劉志偉， 童朝陽， 穆晞惠， 劉 冰， 郝蘭群， 張金平

(防化研究院 國民核生化災害防護國家重點實驗室，北京 102205)

0 引 言

微懸臂梁以其體積小、靈敏度高、不需標記等優(yōu)點受到越來越多的重視，成為近年研究熱點。微懸臂梁讀出方法通常包括光學和電學讀出。關于光學讀出法已有較多文獻報道，但光學測量系統(tǒng)體積龐大、需要超真空、低溫等環(huán)境，一般局限于實驗室生化分析[1]。壓阻式微懸臂梁是一種新型電學讀出懸臂結構，可直接將發(fā)生在微懸臂梁表面的生化反應轉換為電阻信號變化輸出，由于壓阻式微懸臂梁讀出方式簡單、易于集成、成本低、體積小，在現(xiàn)場檢測中更具發(fā)展前景。但由于壓阻式微懸梁加工難度較大，除國外僅有幾篇應用報道外[2～5]，國內報道還非常少。相思子毒素(abrin)是一種劇毒生物毒素，對其進行快速、靈敏檢測極為必要。目前利用壓阻式微懸臂梁傳感器檢測相思子毒素還未見相關的文獻報道。本研究以Abrin為作為靶標，構建了一種靈敏度高、響應快速的壓阻式微懸臂梁免疫傳感器并建立了該傳感器的動力學分析方法，為未來發(fā)展適合生物毒素現(xiàn)場快速檢測的微小型傳感器提供技術基礎和參考依據。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

Abrin和生物素化的Abrin多抗(bio-pcAb)由本實驗室制備；活化生物素(biotin-NHS ester)、3，3，—二巰基丙酸(DDPA)、1—乙基—3—(3—二甲氨丙基)—碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N—羥基琥珀酰亞胺(NHS)、親和素(avidin)、乙醇胺均購自Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA，上海國藥集團有限公司)；PBS緩沖液(pH為7.4，0.01 mol/L)、雙蒸水均自備；其它所用化學品和試劑均為分析純；壓阻式微懸臂檢測平臺由本室與北京大學微電子學研究院共同搭建(圖1)(壓阻微懸臂梁傳感芯片：長200 μm，寬50 μm，厚小于1 μm)。

圖1 搭建的壓阻式微懸臂梁傳感檢測平臺

1.2 基本原理

壓阻式微懸臂梁傳感檢測是基于半導體材料的壓阻效應，在硅微懸臂梁上的合適區(qū)域摻雜上半導體材料，由于微懸臂梁表面生化反應的發(fā)生而使微懸臂梁彎曲時，會引起摻雜區(qū)電阻的變化。因此，可以通過摻雜區(qū)電阻的變化來表征懸臂梁的偏轉。目前，顯示出較強壓阻效應的材料是摻雜的單晶硅。懸臂梁上摻雜區(qū)的電阻變化可用惠斯通電橋來檢測。圖2為壓阻式微懸臂梁免疫傳感器檢測原理示意圖。

圖2 壓阻式微懸臂梁免疫傳感器檢測原理

1.3 實驗方法

1.3.1 Abrin多抗的生物素化

參照文獻[7]制備生物素標記Abrin多抗，用間接ELISA法測定標記前后的抗體效價。

1.3.2 壓阻式微懸臂梁免疫傳感器的構建

將芯片置于檢測池中，加入DDPA(5 g/L)，反應1h使芯片表面金膜包被上羧基；雙蒸水清洗芯片和檢測池后加入EDC(5 g/L)和NHS(5 g/L)，反應0.5 h，完成對微懸臂梁表面的氨基活化修飾；清洗芯片后自然晾干，滴加20 μL100 mg/L的親和素,反應0.5 h；清洗后滴加20 μL 1 mol/L的乙醇胺反應0.5 h以滅活金膜表面殘余的羧基；清洗后將芯片電路與檢測平臺連接并置于含PBS緩沖溶液的檢測池中，加入生物素化的Abrin多抗，實時監(jiān)測抗體固定過程中輸出電壓的變化，待響應電壓穩(wěn)定后，清洗芯片及檢測池。

1.3.3 Abrin檢測

將構建好的傳感芯片置于含0.01 mol/L PBS緩沖溶液的檢測池中，待信號穩(wěn)定后向檢測池中加入不同濃度的Abrin(一個芯片測量一個濃度)，記錄傳感器的響應電壓變化。另以牛血清白蛋白(0.01 mol/L PBS配制)作為對照，考查傳感器的特異性。

1.3.4 免疫傳感器檢測毒素動力學模型

抗原—抗體結合是一種典型的配體、受體結合。根據配體、受體結合的假一級動力學方程[6]與壓阻式微懸臂梁電壓輸出與受力關系的特性，推導出壓阻式微懸臂梁電壓變化與時間之間的動力學模型。根據建立的動力學模型對Abrin的實際檢測數據進行擬合，根據擬合方程求出傳感器對不同濃度毒素反應達到平衡的響應電壓變化ΔUe、響應時間t0，分析模擬值與實測值之間的關系。

1.3.5 Abrin模擬樣品的測定

利用構建的傳感器對Abrin終濃度為16 μg/L的水樣、土樣、牛奶等模擬樣品進行檢測，記錄達到平衡的響應電壓變化ΔUe，并與相同濃度Abrin標準樣品的ΔUe對比，計算檢測的相對回收率、相對標準偏差，以考查傳感器的實際應用效果。

2 結果與討論

2.1 生物素化Abrin多抗效價測定

生物素標記Abrin多抗效價約為1∶2.5×106，與標記前的Abrin多抗效價基本相當，表明生物素標記對Abrin多抗活性沒有明顯的影響。

2.2 微懸臂梁免疫傳感器的構建

加入生物素化Abrin多抗至終濃度分別為195,300 mg/L后，輸出電壓發(fā)生明顯變化，輸出信號在約20 min時基本達到飽和，輸出信號的變化量分別為5,30 μV，表明生物素化Abrin多抗已經修飾到微懸臂梁表面，并且輸出信號隨著Abrin多抗?jié)舛鹊脑黾友杆僭龃?見圖3)。當加入生物素化Abrin多抗的終濃度高于300 mg/L時，傳感器輸出電壓信號無明顯增加，因此，微懸臂梁傳感芯片上Abrin多抗固定濃度確定為300 mg/L。

圖3 固定生物素化Abrin多抗引起微懸臂梁傳感芯片輸出電壓變化實時響應曲線

2.3 Abrin檢測

2.3.1 檢測限與特異性

用構建好的壓阻式微懸壁梁免疫傳感器對低濃度的Abrin進行了檢測，結果見圖4。當Abrin濃度為32,16 μg/L時，輸出電壓變化信號分別為21.0,10.6 μV，當Abrin的濃度進一步降至8 μg/L時，輸出電壓變化信號為2.5 μV，再進一步降低Abrin濃度，基本接近噪音信號(約0.8 μV)，因此,確定傳感器的檢測限為8 μg/L(S/N=3 dB)。整個反應迅速達到平衡，在20 min內完成。對照試驗表明:加入100 μg/L的牛血清白蛋白，輸出電壓信號基本無變化，表明傳感器具有很好的特異性與抗干擾能力。

圖4 壓阻式微懸臂梁免疫傳感器檢測Abrin的實時響應曲線

2.3.2 重現(xiàn)性

對濃度為16 μg/L的Abrin重復5次測定,ΔUe值為(11.2±1.1)μV，相對標準偏差為9.82 %，傳感器重現(xiàn)性較好。

2.4 免疫傳感器檢測毒素動力學模型建立與分析

Abrin(A)溶液加入到固定有Abrin多抗(B)的微懸臂梁傳感芯片檢測池中，發(fā)生如下反應，生成毒素與抗體的結合物(C)

A+BC.

(1)

在檢測池中Abrin濃度很低的情況下，可以認為，免疫反應發(fā)生后，溶液中Abrin (A)濃度有顯著下降，而固定化多抗(B)僅有極少數與Abrin結合，符合配體—受體結合的假一級動力學模型，可假定傳感芯片上Abrin多抗?jié)舛葹橐怀?BT=K),導出如下公式

(2)

式中Ce為反應達到平衡后傳感芯片上形成的抗原—抗體復合物濃度，Ct為t時刻傳感芯片上形成的抗原—抗體復合物濃度，kapp為表觀速率常數，將上式變形得

(3)

設加樣時刻壓阻微懸壁梁傳感器輸出電壓為U0，t時刻輸出電壓為Ut，此時傳感芯片上形成的抗原—抗體復合物濃度為Ct，傳感芯片表面所受的應力為Ft。由于傳感芯片表面所受的應力Ft直接取決于芯片表面形成的抗原—抗體復合物濃度Ct，設Ft=K1Ct(K1為常數)。根據壓阻懸臂梁輸出電壓的變化與懸壁梁上所受的應力F呈正比(比例系數為SF，對于某固定微懸臂梁，SF為一常數)[7]。從而有

ΔU=Ut-U0=SFFt=SFK1Ct,

(4)

即

(5)

將上式代入式(3)得

(6)

在公式兩側同時乘以SFK1得

(7)

設ΔU=Ut-U0，ΔUe=Ue-U0(ΔU為t時刻的輸出電壓與零時刻輸出電壓之差，ΔUe為反應達到平衡時刻的輸出電壓與零時刻的輸出電壓之差)，從而有

(8)

加入Abrin以后，需要一個時間傳感器才能響應。設響應時間為t0，則對式(8)進行修正，可變形為

(9)

即ΔU隨時間t變化的理論模型。

根據上述建立的理論模型，對檢測Abrin的實際結果數據進行了非線性回歸分析，結果見圖5和表1。

圖5 壓阻式微懸臂梁免疫傳感器檢測Abrin的實測數據動力學擬合曲線

從表1可以看出:建立的壓阻式微懸臂梁免疫傳感器ΔU隨t變化的動力學模型(方程式(9))能很好地與不同濃度的Abrin的實測數據進行擬合，相關系數R值均在0.971 1以上(P<0.001)，根據擬合方程求出的傳感器對不同濃度Abrin反應達到平衡時的響應電壓變化ΔUe、響應時間t0均與實測值非常接近，表明壓阻式微懸臂梁免疫傳感器檢測Abrin遵循方程式(9)建立的動力學模式。

表1 壓阻式微懸臂梁免疫傳感器檢測Abrin的實測數據動力學擬合分析

2.5 Abrin模擬樣品的測定

采用該傳感器對水樣、土樣、牛奶等模擬樣品進行了測定(表2)。結果表明:對于模擬樣品的檢測，傳感器具有較好的回收率和重現(xiàn)性。

表2 相思子毒素模擬樣品的測定

3 結 論

本文利用生物素—親和素放大系統(tǒng)構建了一種壓阻式微懸壁梁免疫傳感器，實現(xiàn)了對Abrin的快速靈敏檢測，對Abrin的檢測限達到8 μg/L，反應在20 min內基本達到平衡，傳感器具有很好的特異性、重現(xiàn)性與抗干擾能力。建立了壓阻式微懸臂梁免疫傳感器檢測毒素的反應動力學模型，根據模型方程求出Abrin檢測的平衡響應電壓變化ΔUe、響應時間t0等擬合值均與實測值非常接近，這為表征分析壓阻式微懸臂梁免疫傳感器檢測靶分子的動力學過程提供了理論參考依據。該傳感器直接將發(fā)生在微懸臂梁表面的生化反應轉換為電阻信號變化進行輸出，克服了傳統(tǒng)光學讀出微懸臂梁傳感器體積龐大、需要超真空、低溫等環(huán)境的缺陷，具有不需標記、靈敏度高、操作簡單、檢測快速等特點，在生化毒素實時檢測和現(xiàn)場快速檢測方面有較大優(yōu)勢，具有很好的發(fā)展前景。

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