賈永紅+孫艷香+張江麗+馮雪+袁曉圓+張冰

摘要：在建立百脈根（Lotus corniculatus L .）高頻再生體系的基礎(chǔ)上，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將豬瘟病毒（CSFV）表面抗原E2基因轉(zhuǎn)化進(jìn)入百脈根，獲得轉(zhuǎn)基因陽性株系5個。并對遺傳轉(zhuǎn)化體系中關(guān)鍵性因素進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，最優(yōu)化體系為子葉預(yù)培養(yǎng)3 d后，用OD600nm為0.5±0.05的菌液侵染30 min，共培養(yǎng)3 d并添加AS（乙酰丁香酮），選擇培養(yǎng)基中卡那霉素濃度為50 mg/L，可獲得理想的轉(zhuǎn)化效率。為抗豬瘟可食性疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：百脈根（Lotus corniculatus L .）；高頻再生；遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號：Q78文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：0439-8114（2014）10-2368-05

Establishing Regeneration System of Lotus corniculatus L. with High Frequency and Genetic Transformation of CSFV E2 Gene

JIA Yong-hong，SUN Yan-xiang，ZHANG Jiang-li，F(xiàn)ENG Xue，YUAN Xiao-yuan，ZHANG Bing

（College of Life Science，Langfang Normal College，Langfang 065000，Hebei，China）

Abstract： Based on the established regeneration system of Lotus corniculatus L. with high frequency and mediated by Agrobacterium tumefaciens，5 lines of transgenic Lotus corniculatus L. with E2 gene of classical swine fever virus（CSFV） were obtained. Several key factors affecting genetic transferring system were optimized during E2 genetic transformation. The results showed that the optimal system was pre-cultivated cotyledon for 3 days and infected with Agrobacterium at the concentration of OD600nm=0.5±0.05 about 30 min. After co-cultured for 3 days， 100 μmol/L AS was added in culture medium containing 50 mg/L Kanamycin. Under this system， ideal efficiency of genetic transformation was achieved. It will lay a foundation for edible vaccine of resisting swine fever.

Key words： Lotus corniculatus L.；high frequency regeneration；genetic transformation

基金項目：廊坊師范學(xué)院自然科學(xué)基金項目（LSZY201105）；廊坊師范學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201310100007）；廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院“本科生參與研究性項目”（SKCYZ201302）

百脈根（Lotus corniculatus L.）是世界上廣泛栽培的多年生優(yōu)良豆科牧草之一，在水土保持和牧場改良等方面也有獨特的作用。百脈根細(xì)胞全能性強，容易獲得高頻再生植株，遺傳轉(zhuǎn)化率相對較高、轉(zhuǎn)基因植株生長速度快[1，2]，是植物轉(zhuǎn)基因和生物固氮機理等研究的良好材料。近年來植物作為生物外源蛋白的天然生物反應(yīng)器生產(chǎn)可食性疫苗和植物抗體的研究已取得了可喜的進(jìn)展，引導(dǎo)著國際疫苗研制開發(fā)的新潮流[3-5]，而E2基因作為外源基因研制抗豬瘟轉(zhuǎn)基因疫苗尚屬有限[6，7]，本研究以豬瘟病毒表面抗原E2基因為外源基因，以農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法實施百脈根為轉(zhuǎn)基因受體的遺傳轉(zhuǎn)化，以期為抗豬瘟轉(zhuǎn)基因可食性疫苗的研制提供參考方案。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料供試百脈根：暖季型，購至上海春茵種業(yè)有限公司。含E2外源基因的根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105（pGN-E2），其中pGN載體由南開大學(xué)白艷玲老師提供。

1.1.2基本培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基：大量元素、微量元素、鐵鹽、有機成分所用試劑均為國產(chǎn)分析純，蔗糖濃度均為30 g/L，瓊脂均為8 g/L，6-BA 配成1 mg/L貯液。

抗生素類：羧芐青霉素（Car，100 mg/L）、卡那霉素（Kana，50 mg/L），頭孢霉素（Cef，300 mg/L、450 mg/L），均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)口分裝試劑配成1 000×貯液-20 ℃保存。

1.2方法

1.2.1無菌苗的獲得選取子粒飽滿的百脈根種子，采用3種方法處理種子：①自來水沖洗數(shù)次，室溫浸泡8～12 h，換水2～3次，然后在超凈工作臺上浸入70%乙醇并振蕩3 min，0.1%升汞振蕩消毒5 min。②百脈根種子先用清水沖洗數(shù)次，然后在超凈工作臺上浸入70%乙醇并振蕩5 min，0.1%升汞振蕩消毒8 min。③百脈根種子先用砂紙輕輕打磨，然后清水沖洗數(shù)次，在超凈工作臺上浸入70%乙醇并振蕩5 min，0.1%升汞振蕩消毒8 min。處理過的種子分別用無菌水沖洗5次以上，控干后接種于MS培養(yǎng)基上，在（25±1） ℃條件下培養(yǎng)5～7 d，即可獲得無菌苗。

1.2.2不定芽的再生和分化無菌條件下把6～7 d苗齡無菌苗的子葉橫切成兩半， 下胚軸切成約0.5 cm長度的小段，同期把2周苗齡的真葉橫切成兩半，莖段切成約0.5 cm長度， 分別接種到分化培養(yǎng)基（MS+0.1 mg/L 6-BA）上，置于光照培養(yǎng)室中，（25±1） ℃，光/暗周期16 h/8 h，光照度2 000 lx。

1.2.3再生苗生根及移栽從分化培養(yǎng)基中取出超過2 cm高的叢生苗，MS液體培養(yǎng)基中分割成單株，插入無激素MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，待根長達(dá)到2 cm以上，先在培養(yǎng)室去掉封瓶膜煉苗4～5 d，然后在溫室中適應(yīng)3 d后小心地取出再生苗，流水小心沖洗根系，培養(yǎng)基徹底洗掉后移入花盆，移栽后的前幾天覆以塑料膜保濕。高度不足2 cm的叢生苗分割后，轉(zhuǎn)入新的分化培養(yǎng)基中繼代以誘導(dǎo)再生。

1.2.4外植體預(yù)培養(yǎng)、侵染和共培養(yǎng)用于侵染的百脈根子葉和下胚軸取自7 d左右的無菌苗，真葉取自12～14 d苗齡的無菌苗，子葉和真葉橫切為兩半，下胚軸切成0.5 cm長度小段，接種到含0.1 mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)3～4 d，取出并浸入用MS液體培養(yǎng)基懸浮的工程菌液中，輕搖侵染30 min后，期間用滅菌鑷子攪動以使其充分接觸菌液，移除菌液后，用無菌純水和MS液體培養(yǎng)基洗滌外植體各1次，無菌濾紙吸干子葉和下胚軸表面多余液體，接入共培養(yǎng)基 （MS+0.1 mg/L 6-BA） 中，無光照共培養(yǎng)3 d左右。同時對未經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的外植體進(jìn)行同樣的侵染和共培養(yǎng)處理。以未經(jīng)侵染的子葉、下胚軸外植體作對照。

1.2.5侵染后外植體的選擇培養(yǎng)及繼代共培養(yǎng)3 d后， 至外植體周圍形成淡淡的菌圈后，轉(zhuǎn)入選擇分化培養(yǎng)基（MS+0.1 mg/L 6-BA +Kana 50mg/L +Cef 300 mg/L +Car 100 mg/L）中進(jìn)行轉(zhuǎn)化體的篩選培養(yǎng)與再生芽的誘導(dǎo)，組培室培養(yǎng)條件：（25±1） ℃，光/暗周期16 h/8 h，光照度2 000 lx 。待不定芽長成2 cm以上的無根苗，將分化出的無根苗再行剪切成0.5 cm長度莖段和無葉柄葉片，水平接入新的選擇分化培養(yǎng)基中繼代，對于叢生芽則分割成小塊后轉(zhuǎn)入新的選擇分化培養(yǎng)基中繼續(xù)分化，每4周繼代1次。并將第三次繼代的卡那霉素濃度升至75 mg/L。

1.2.6轉(zhuǎn)化體的PCR鑒定繼代得到的再生苗取其鮮嫩葉片3～4片，采取CTAB法提取基因組DNA。以提取的轉(zhuǎn)基因植株（或無根苗）的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴增，陽性克隆的質(zhì)粒DNA為陽性對照，以非轉(zhuǎn)基因百脈根基因組DNA為陰性對照。PCR引物為E2-UP：GCTTCTAGAATGCTAGCCTGCAAGGAAGATTAC；E2-DN：TCAGAGCT CTCAGTCAGTCGCATCCAGGTCAAAC由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。PCR反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer 2 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，Taq酶（5 U/μL）0.5 μL，DNA模板1 μL，去離子水補足至20 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30次循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。對PCR檢測陽性株系采用北京天根生物公司RNAplant試劑盒提取葉片總RNA，去除基因組DNA后用MMLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，進(jìn)一步進(jìn)行RT-PCR擴增，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

2結(jié)果與分析

2.1無菌苗制備方法比較

三種方法消毒種子，均可獲得生長良好的無菌苗?！?.2.1”中方法③經(jīng)砂紙打磨處理但未浸泡的種子發(fā)芽率最高，可達(dá)到80%以上，接種第三天即有大量種子萌發(fā)出芽，但萌發(fā)時間差異較大，一周后仍有開始萌發(fā)的種子；其次是方法②未經(jīng)砂紙打磨和浸泡的種子，發(fā)芽率在73%以上，萌發(fā)時間差異與方法③相似；方法①先行浸種但發(fā)芽率較低，只有56%，可能由于乙醇和升汞對已經(jīng)吸漲的種子造成毒性損傷而致，但萌發(fā)時間較為整齊，適于批量處理。

2.2外植體的再生和生根

無菌苗的子葉、下胚軸、真葉和莖段作為外植體，其分化情況不同（表1），其中以子葉的不定芽分化頻率和再生苗發(fā)育情況最為理想，其次為下胚軸。子葉外植體7 d后切口和邊緣都出現(xiàn)了綠色芽點，進(jìn)一步形成不定芽，3周后不定芽高度達(dá)到2 cm；下胚軸的斷口處有綠色愈傷逐漸膨大，部分可分化出不定芽；真葉和莖段再生速度較慢，尤其莖段分化形成的愈傷組織褐化和玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重，分化頻率較低。

分化培養(yǎng)基上繼代形成的再生苗密集叢生，分割成單株插入無激素MS培養(yǎng)基中，7 d后切口周圍出現(xiàn)新的芽點，同時長出白色幼根，14 d后根長達(dá)到2 cm，根誘導(dǎo)率達(dá)到100%。經(jīng)煉苗后，移栽成活率可達(dá)78 %，植株生長正常。

2.3百脈根的遺傳轉(zhuǎn)化

本研究對預(yù)培養(yǎng)和不經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的百脈根子葉、下胚軸、真葉進(jìn)行侵染，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的外植體經(jīng)農(nóng)桿菌侵染處理后共培養(yǎng)階段農(nóng)桿菌繁殖較快，外植體開始變黃，在選擇培養(yǎng)時變灰甚至褐化，最終褐化死亡，成活率僅為4.3%；外植體經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后轉(zhuǎn)化效率大大提高，預(yù)培養(yǎng)3～4 d的子葉明顯增大變厚、下胚軸明顯長大增粗，侵染后經(jīng)共培養(yǎng)再轉(zhuǎn)入選擇分化培養(yǎng)基中，7 d后子葉切口和邊緣陸續(xù)分化出綠色芽點，14 d后不定芽超過0.5 cm，下胚軸則在斷口處長出黃綠色愈傷組織并逐漸膨大，也有的直接長出不定芽（圖1、圖2），子葉、下胚軸平均抗性再生芽誘導(dǎo)率分別達(dá)到26%、15%。真葉再生速度慢，大多數(shù)外植體逐漸黃化以致褐化死亡，分化頻率較低，僅為6%。繼代培養(yǎng)無葉柄葉片和莖段均可再分化出芽，葉片仍以直接分化出不定芽為主，莖段則從愈傷組織上形成叢生芽（圖3～圖5），二者形成的繼代叢生苗均可正常生根（圖6）。

農(nóng)桿菌（EHA105）濃度和侵染時間對轉(zhuǎn)化效率影響較大，其中工程菌液的OD600 nm為0.45～0.55時效果最佳，活化后的菌液按1%接種量，約經(jīng)過7～8 h擴繁即可達(dá)到對數(shù)生長期。濃度過低（OD600 nm<0.3）轉(zhuǎn)化率偏低，選擇培養(yǎng)期間95%的外植體黃化死亡；濃度太高時（OD600 nm>0.8）外植體成活率降低，共培養(yǎng)3 d的外植體周圍及表面均有農(nóng)桿菌覆蓋，選擇培養(yǎng)基上農(nóng)桿菌仍然無法抑制，很快褐化死亡。本研究設(shè)定侵染時間為30 min，時間太短或太長也都會降低轉(zhuǎn)化效率。共培養(yǎng)時間以3 d為宜，至外植體周圍出現(xiàn)薄霧狀的菌圈，轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基后農(nóng)桿菌能得到有效控制，外植體成活率和分化率較高；共培養(yǎng)超過4 d，農(nóng)桿菌菌落明顯，甚至有些外植體表面被農(nóng)桿菌覆蓋，選擇培養(yǎng)時農(nóng)桿菌不容易控制，造成外植體變黃，繼而褐化死亡，轉(zhuǎn)化效率降低。將共培養(yǎng)中農(nóng)桿菌包圍的尚未變黃的外植體用無菌水、含有的Cef 300 mg/L +Car 100 mg/L的MS、MS培養(yǎng)基依次浸洗后轉(zhuǎn)接到選擇培養(yǎng)基上，可有近40%的外植體可繼續(xù)分化，但需要多次浸洗轉(zhuǎn)接才可徹底脫菌。

對照組未經(jīng)侵染的子葉、下胚軸等外植體，經(jīng)預(yù)培養(yǎng)6 d后轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基，14 d后仍無芽分化，呈土黃色或黃色，部分外植體切口處出現(xiàn)小塊的愈傷組織，生長極緩慢，逐漸白化死亡。

此外，試驗中對共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中添加乙酰丁香酮（AS）100 μmol/L）與否進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)添加AS的外植體經(jīng)選擇培養(yǎng)后存活率明顯增加，說明添加AS可提高抗性芽的形成。乙酰丁香酮（AS）可誘導(dǎo)農(nóng)桿菌Vir基因活化[9]，從而促進(jìn)外源基因的整合，提高轉(zhuǎn)化率。

本研究得到的抗性苗經(jīng)提取基因組DNA 和RNA，并進(jìn)行PCR和RT-PCR檢測（圖7～圖9），5個轉(zhuǎn)基因株系得到大約1 000 bp的擴增條帶，電泳譜帶符合預(yù)期，說明外源的E2基因已轉(zhuǎn)化進(jìn)入百脈根基因組中并得到轉(zhuǎn)錄。

3討論

3.1百脈根高頻再生體系外植體的選擇

百脈根無菌苗取得的外植體，均可不同程度地分化成苗，再生能力較強，其中以子葉的不定芽分化頻率和再生苗發(fā)育情況最為理想，與孫艷香等[1]、張振霞等[8]的結(jié)果類似。子葉多數(shù)可通過器官發(fā)生途徑直接再生出芽，幾乎沒有或僅有少量愈傷組織出現(xiàn)，芽較易伸長，每片葉的平均再生芽數(shù)較多。不通過愈傷組織的再生途徑不但可以避免變異的發(fā)生而且可以縮短子葉再生出芽的時間[10，11]，利于轉(zhuǎn)基因操作及抗性芽篩選。下胚軸分化不定芽的頻率低于子葉，多數(shù)需要經(jīng)過愈傷組織的形成，再分化出不定芽，芽生長相對于子葉再生的芽較慢。真葉幾乎不形成愈傷組織，但不定芽分化頻率較低，而且芽生長較為緩慢，苗不夠強壯；莖段也可以在愈傷組織上分化出不定芽，但分化率低，分化出不定芽時間長，生長慢，出現(xiàn)明顯玻璃化和苗畸形。因此選擇子葉作為轉(zhuǎn)基因操作的外植體最為理想，且材料容易取得，易于誘導(dǎo)再生不定芽。

3.2百脈根遺傳轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

本研究通過對預(yù)培養(yǎng)和不經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的百脈根子葉、下胚軸、真葉進(jìn)行侵染對比，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的外植體轉(zhuǎn)化效率明顯提高，可能是外植體在預(yù)培養(yǎng)期間離體組織進(jìn)入快速分裂期，處于良好的感受狀態(tài)，易于接受外源DNA，同時分裂細(xì)胞可產(chǎn)生小分子量的酚類化合物，促進(jìn)農(nóng)桿菌向受傷細(xì)胞表面吸附并激活Vir基因[12，13]，進(jìn)而獲得較高的轉(zhuǎn)化效率。而未經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的外植體，由于離體組織處于應(yīng)激過渡階段，未進(jìn)入快速分裂期和最佳感受狀態(tài)，侵染后農(nóng)桿菌工程菌繁殖較快，外植體細(xì)胞分裂受到抑制而相對較慢，轉(zhuǎn)化細(xì)胞較少，因而在選擇培養(yǎng)時褐化死亡；預(yù)培養(yǎng)時間太長則可能導(dǎo)致傷口愈合、細(xì)胞壁完全修復(fù)，不利于T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合，轉(zhuǎn)化效率明顯降低。因此，百脈根子葉的預(yù)培養(yǎng)時間應(yīng)控制在3～4 d內(nèi)。在試驗中對于預(yù)培養(yǎng)時間過長的外植體采取重新分割的方法，仍然可以取得較好的轉(zhuǎn)化效率。說明未愈合的傷口是遺傳轉(zhuǎn)化的重要條件。

農(nóng)桿菌濃度和侵染時間對轉(zhuǎn)化效率影響較大，濃度或侵染時間不適宜都會降低轉(zhuǎn)化率，可能是濃度偏低或侵染時間太短時，進(jìn)入外植體的農(nóng)桿菌數(shù)量少而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率偏低，濃度太高或侵染時間太長時，附在外植體表面和進(jìn)入外植體組織內(nèi)的工程菌數(shù)量大，農(nóng)桿菌的繁殖得不到抑制，外植體周圍及表面均被農(nóng)桿菌覆蓋，外植體細(xì)胞分裂受到競爭性抑制，導(dǎo)致成活率降低。共培養(yǎng)時間過長，同樣可導(dǎo)致農(nóng)桿菌過度繁殖而降低外植體成活率[14，15]。適時清除外植體表面過多的農(nóng)桿菌可降低外植體的死亡率。本研究表明，百脈根遺傳轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌濃度控制在OD600 nm 0.45～0.55，侵染時間在30 min內(nèi)可獲得較好的轉(zhuǎn)化效率。

3.3抗生素的種類和劑量

本研究在百脈根外植體對卡那霉素、農(nóng)桿菌EHA105對頭孢霉素和羧芐青霉素的敏感試驗基礎(chǔ)上，確定選擇培養(yǎng)基中抗生素的配比為：Kana 50 mg/L+Cef 300 mg/L +Car 100 mg/L，同時試驗中對未經(jīng)侵染的外植體進(jìn)行選擇培養(yǎng)，結(jié)果外植體全部白化死亡。這表明選擇培養(yǎng)基中適宜濃度的卡那霉素可有效抑制非轉(zhuǎn)化組織的生長和再生，從而篩選出對卡那霉素具有抗性的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，頭孢菌素和羧芐青霉素則起到抑制農(nóng)桿菌繁殖，進(jìn)而使外植體組織徹底脫菌。

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