朱紅霞 王保芳 牛保華

Burkitt淋巴瘤是一種比較少見的淋巴造血組織腫瘤，在歐美占兒童淋巴瘤的30%～50%，而散發(fā)型Burkitt淋巴瘤在全世界各地均有發(fā)生[1]。在Burkitt淋巴瘤的治療方面，盡管高強(qiáng)度，化療方案的改進(jìn)使Burkitt淋巴瘤治療有了很大的提高，新的化療藥物和治療方案仍有待發(fā)現(xiàn)。最近研究認(rèn)為噻唑烷二酮類(thiazolidinedione，TZD)化合物為過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ)配體，可通過激活PPAR-γ發(fā)揮誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤增殖和血管生成等作用[2]，但尚未見其對(duì)人Burkitt淋巴瘤細(xì)胞系作用的報(bào)道。本研究旨在研究羅格列酮（Rosiglitazone，RGZ）對(duì)人Burkitt淋巴瘤raji紫杉醇耐藥細(xì)胞株增殖和凋亡的影響，并探討其逆轉(zhuǎn)Burkitt淋巴瘤耐藥的作用及機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人Burkitt淋巴瘤raji細(xì)胞株購(gòu)自南京凱基生物有限公司。RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。小牛血清購(gòu)自杭州四季青公司。羅格列酮（Rosiglitazone，RGZ）購(gòu)自葛蘭素史克公司。UA和碘化丙啶(propidium iodide，PI)染料和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；β-actin，P-gp和MRP抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 。辣根過氧化酶標(biāo)記物山羊抗小鼠IgG(二抗)和堿性磷酸酶顯色試劑盒購(gòu)于北京中山生物技術(shù)有限公司。RGZ溶于RPMI 1640培養(yǎng)基制成100mmol/L的母液，過濾除菌后-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和耐藥細(xì)胞株的建立 raji細(xì)胞接種于含10%胎牛血清體積分?jǐn)?shù)的RPMI 1640培養(yǎng)液(pH值7.2～7.4，含100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素)。于37℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

采用逐步間歇藥物濃度遞增法建立紫杉醇耐藥細(xì)胞株，歷時(shí)172d，藥物濃度從5.0nmol/L 開始逐漸加量，最終獲得了一株能在25nmol/L的TAX含藥培養(yǎng)液穩(wěn)定生長(zhǎng)的raji細(xì)胞耐藥細(xì)胞株，命名為raji/TAX25。該細(xì)胞株能在25nmol/L的TAX含藥培養(yǎng)液穩(wěn)定生長(zhǎng)，持續(xù)增殖，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)。

1.2.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)RGZ對(duì)各組Raj i細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 將細(xì)胞分為4組：未加藥的空白對(duì)照組，2RGZ組，25nmol/L TAX組及 RGZ+25nmol/L TAX組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度105個(gè)細(xì)胞/mL接種于24孔板。加入RGZ終濃度為50μmol/L的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，設(shè)陰性對(duì)照和空白對(duì)照，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h。結(jié)束培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率＝(對(duì)照組細(xì)胞數(shù)-給藥組細(xì)胞數(shù))/對(duì)照組細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡細(xì)胞 收集50μmol/LRGZ作用 48h后的各組raji細(xì)胞，每組細(xì)胞數(shù)至少1×106個(gè)細(xì)胞，輕輕吹打制備單細(xì)胞懸液細(xì)胞。懸液細(xì)胞移入1.5mL離心管，4℃，500g，離心5min。小心移去上清液，冰預(yù)冷PBS洗細(xì)胞2次。上流式細(xì)胞儀雙染檢測(cè)凋亡進(jìn)行參數(shù)獲取和資料分析，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 蛋白印跡法檢測(cè)RGZ對(duì)raji細(xì)胞P-gp和MRP蛋白表達(dá)的影響 收集50μmol/L RGZ作用 48h后的各組raji細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白?？偟鞍诐舛冉?jīng)Bio-Rad測(cè)定，SDSPAGE 凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。加稀釋一抗抗體（靶蛋白抗體）靜置過夜，TBST漂洗，加入二抗孵育，熒光顯色，沖洗。掃描蛋白印跡膠片后觀察結(jié)果，按照靶蛋白/β-actin蛋白比例用Scion圖像分析系統(tǒng)（4.02版本）分析條帶影像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS 6.12和SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。MTT結(jié)果采用兩因素方差分析，RT-PCR結(jié)果采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耐藥株raji/TAX25的建立及RGZ對(duì)raji細(xì)胞紫杉醇耐藥的逆轉(zhuǎn)作用 raji和raji/TAX25細(xì)胞增殖速度接近，倍增時(shí)間分別為73.4h和74.8h，表明在產(chǎn)生耐藥性后細(xì)胞增殖未受到明顯抑制。RGZ對(duì)raji細(xì)胞紫杉醇耐藥的逆轉(zhuǎn)作用，不同組間細(xì)胞增值率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=39.273，P＜0.01）（見圖 1）。

圖1 RGZ對(duì)raji細(xì)胞紫杉醇耐藥的逆轉(zhuǎn)作用

2.2 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率 空白對(duì)照組的raji和紫杉醇耐藥的raji/TAX25細(xì)胞的凋亡率較低，經(jīng)10μmol/LRGZ作用48h，細(xì)胞凋亡率分別增加至(7.07±2.95)和(18.43±5.58)。與對(duì)照組(1.32±1.11)和(2.51±1.73)相比，不同時(shí)間組間細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明RGZ對(duì)raji細(xì)胞耐藥的逆轉(zhuǎn)可以增加紫杉醇的誘導(dǎo)凋亡作用(F=7.301，P＜0.01)（見圖2）。

圖2 RGZ對(duì)各組raji細(xì)胞凋亡的影響

2.3 Western蛋白印跡法檢測(cè)各細(xì)胞P-gp和MRP蛋白表達(dá)的變化 raji/TAX25細(xì)胞P-gp的表達(dá)（0.488±0.122）明顯高于對(duì)照組（0.146±0.074）和 RGZ組（0.074±0.086）細(xì)胞，經(jīng)10μmol/LRGZ作用48h降低至（0.198±0.114），不同組間細(xì)胞差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.787，P＜0.01)。raji/TAX25細(xì)胞MRP的表達(dá)（0.362±0.109）明顯高于對(duì)照組（0.09±0.094）和 RGZ組細(xì)胞（0.076±0.083），經(jīng) 10μmol/LRGZ作用48h降低至（0.149±0.089），不同組間細(xì)胞差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.218，P＜0.05)。RGZ對(duì)raji細(xì)胞紫杉醇耐藥的逆轉(zhuǎn)作用與下調(diào)耐藥相關(guān)蛋白P-gp和MRP的表達(dá)密切相關(guān)（見圖3）。

3 討論

圖3 RGZ對(duì)各組raji細(xì)胞P-gp和MRP蛋白表達(dá)的影響

PPAR-γ是由配體激活的家族，屬II型核受體超家族成員，參與脂肪細(xì)胞形成、分化、胰島素敏感、調(diào)控細(xì)胞周期、抑制炎癥反應(yīng)等方面生理調(diào)節(jié)作用[3]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)PPAR-γ與多種腫瘤關(guān)系密切，在多種腫瘤組織中均有過度表達(dá)，對(duì)人類腫瘤細(xì)胞的增殖及凋亡具有重要的調(diào)節(jié)作用[4]。RGZ是PPAR-γ合成激動(dòng)劑。是臨床治療2型糖尿病的主要藥物之一，RGZ是生物利用度最高、藥效最強(qiáng)且其毒副作用相對(duì)較小的一種TZDs類藥物[5]。本研究證實(shí)，RGZ對(duì)人Burkitt淋巴瘤raji紫杉醇耐藥細(xì)胞株raji/TAX25細(xì)胞有顯著的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用，提示RGZ具有逆轉(zhuǎn)Burkitt淋巴瘤raji細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥的作用。

臨床上腫瘤化療失敗的主要原因是腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞多藥耐藥(multiple drug resistance，MDR)。MDR是指腫瘤細(xì)胞在針對(duì)一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性的同時(shí)也對(duì)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制完全不同的其他類型抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥[6]。因而研究MDR產(chǎn)生的機(jī)制并尋求有效的耐藥逆轉(zhuǎn)劑及逆轉(zhuǎn)措施來克服腫瘤臨床耐藥，提高化療效果的重要手段已成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。為此本實(shí)驗(yàn)觀察了RGZ對(duì)人Burkitt淋巴瘤raji細(xì)胞凋亡的影響：流式細(xì)胞儀可發(fā)現(xiàn)RGZ作用后raji和raji/TAX25細(xì)胞的凋亡率高于對(duì)照組和耐藥組，進(jìn)一步證明RGZ可有效逆轉(zhuǎn)Burkitt淋巴瘤raji細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥的作用。

MDR分為兩種表型：天然性耐藥和獲得性耐藥。天然性耐藥是指首次使用化療藥物腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的耐藥，而獲得性耐藥則是指在化療過程中腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的耐藥[7]。MDR的機(jī)制十分復(fù)雜，目前認(rèn)為MDR是多種機(jī)制共同作用的結(jié)果。MDR產(chǎn)生的分子機(jī)制主要包括：跨膜蛋白增加藥物轉(zhuǎn)運(yùn)和外排、抗細(xì)胞凋亡信號(hào)增強(qiáng)、酶系統(tǒng)活性增強(qiáng)等，其中跨膜蛋白增加藥物轉(zhuǎn)運(yùn)和外排最為重要，因而研究的也最多?？缒さ鞍字饕≒-糖蛋白(permeability glycoprotein，P-gp)和多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP)，此類蛋白將抗腫瘤藥物從腫瘤細(xì)胞中泵出，從而減少其在細(xì)胞中聚集而起作用[8-9]。為探討RGZ逆轉(zhuǎn)Burkitt淋巴瘤raji細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥的分子機(jī)制，我們觀察了RGZ作用后細(xì)胞中耐藥基因P-gp和MRP表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，raji/TAX25組P-gp和MRP表達(dá)明顯高于對(duì)照組，RGZ作用于后raji/TAX25細(xì)胞P-gp和MRP表達(dá)的下調(diào)，提示RGZ逆轉(zhuǎn)Burkitt淋巴瘤raji細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥的分子機(jī)制是通過抑制P-gp和MRP表達(dá)來起作用的。

本研究結(jié)果認(rèn)為RGZ能夠抑制人Burkitt淋巴瘤raji細(xì)胞的生長(zhǎng)，并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。從這一結(jié)論可以看出，RGZ可望成為臨床上治療Burkitt淋巴瘤的有效藥物或輔助用藥。但其作用途徑和機(jī)制，尚需進(jìn)一步研究。另外，應(yīng)通過體內(nèi)研究包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究來進(jìn)一步探討RGZ對(duì)Burkitt淋巴瘤的治療作用。

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