劉文娟 宮玉典

卵巢癌是致死率最高的婦科惡性腫瘤之一，其致死率為癌癥總致死率的5%，嚴(yán)重威脅女性健康[1]。目前，卵巢癌的主要治療方法為化療，使用的一線藥物有紫杉醇，鉑類等[2]。研究顯示卵巢癌患者對(duì)紫杉醇及鉑類藥物治療有較好的反應(yīng)性，使用之初可明顯抑制或緩解，但患者在持續(xù)治療之后病情會(huì)惡化或復(fù)發(fā)，從而導(dǎo)致死亡。持續(xù)使用藥物一段時(shí)間患者的病情加重與腫瘤細(xì)胞的耐藥性相關(guān)，腫瘤細(xì)胞對(duì)這些化學(xué)治療藥物耐受，這些化學(xué)治療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用下降或消失，最終導(dǎo)致患者應(yīng)藥物耐受而死亡。順鉑是治療卵巢癌的重要化療藥，本研究使用耐紫杉醇的卵巢癌細(xì)胞SKOV3-TR30為研究對(duì)象，觀察順鉑對(duì)其生物學(xué)功能的影響，探討SKOV3-TR30耐順鉑的主要機(jī)制，為SKOV3-TR30耐藥性的逆轉(zhuǎn)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 材料 人卵巢上皮細(xì)胞癌細(xì)胞株SKVO3購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心（ATCC），使用中等劑量間隙結(jié)合低劑量維持的方法誘導(dǎo)建立SKOV3-TR30，使用含紫杉醇的McCOY’5A培養(yǎng)基對(duì)SKOV3-TR30進(jìn)行培養(yǎng)傳代，使用時(shí)將SKOV3-TR30用不含紫杉醇的McCOY’5A培養(yǎng)基培養(yǎng)3周。順鉑購(gòu)自山東齊魯制藥有限公司，MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5二苯基四氮唑溴鹽)，細(xì)胞周期試劑盒和凋亡試劑盒均購(gòu)于森貝伽（南京）生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞周期檢測(cè)將SKOV3及SKOV3-TR30細(xì)胞接種6孔板，保持每孔細(xì)胞數(shù)4×105/ml，37℃，5%CO2培養(yǎng)24h后換液，分別加入順鉑濃度為25.65、56.82μmol/L（此濃度為該細(xì)胞藥物的半抑制濃度）的培養(yǎng)液培養(yǎng)48h，使用細(xì)胞周期試劑盒進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。

1.2.2 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 將SKOV3及SKOV3-TR30細(xì)胞接種 96 孔板，5%CO2培養(yǎng) 12、24、36、48h后換液，分別加入順鉑濃度為25.65、56.82μmol/L（此濃度為該細(xì)胞藥物的半抑制濃度）的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，之后加入MTT每孔20μl，37℃、5%CO2培養(yǎng)4h，每孔加入DMSO 200μl，使用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)540nm處每孔吸光度。細(xì)胞凋亡率=（加藥細(xì)胞吸光度-對(duì)照細(xì)胞吸光度）/對(duì)照細(xì)胞吸光度×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（)表示，使用方差分析（Oneway ANOVA)分析各組組間差異，計(jì)數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 順鉑對(duì)SKOV3，SKOV3-TR30細(xì)胞周期的影響 圖1、圖2為流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果，結(jié)果顯示未加藥時(shí)SKOV3，SKOV3-TR30主要分布與G0/G1期，兩者細(xì)胞數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，順鉑處理48h后，各加藥細(xì)胞與其未加藥的細(xì)胞比較G0/G1期細(xì)胞均減少，且與未加藥細(xì)胞比較，細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但SKOV3的減少幅度大于SKOV3-TR30（P＜0.05），兩者均停留于G2/M期，且SKOV3 滯留于G2/M期細(xì)胞的增加幅度大于SKOV3-TR30（P＜0.05）。

圖1 未加藥細(xì)胞周期測(cè)定結(jié)果

圖2 加藥后細(xì)胞周期測(cè)定結(jié)果

2.2 順鉑對(duì)SKOV3，SKOV3-TR30細(xì)胞凋亡的影響表1為順鉑對(duì)SKOV3、SKOV3-TR30細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，順鉑作用 0、12h時(shí)，SKOV3、SKOV3-TR30 細(xì)胞凋亡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，順鉑作用 24、36、48h，SKOV3、SKOV3-TR30細(xì)胞凋亡與之前相比明顯增多（P＜0.05），且SKOV3凋亡細(xì)胞比例明顯高于SKOV3-TR30，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 順鉑對(duì)SKOV3，SKOV3-TR30 細(xì)胞凋亡的影響（%，）

表1 順鉑對(duì)SKOV3，SKOV3-TR30 細(xì)胞凋亡的影響（%，）

注：與0h比較，aP＜0.05,與同時(shí)間點(diǎn)SKOV3-TR30比較，bP＜0.05

時(shí)間 SKOV3 SKOV3-TR30 0h 8.47±2.15 8.16±2.27 12h 20.48±2.36 21.85±2.41 24h 48.57±4.29ab 31.62±4.72a 36h 64.28±4.67ab 41.91±5.71a 48h 87.26±6.27ab 54.62±6.19a

3 討論

SKOV3-TR30為耐紫杉醇的人卵巢上皮細(xì)胞癌細(xì)胞株。已有研究認(rèn)為腫瘤細(xì)胞耐紫杉醇的記住主要如下，細(xì)胞膜上存在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如P-gp，這些蛋白將細(xì)胞中的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外，從而降低藥物在細(xì)胞中的濃度；腫瘤細(xì)胞微管的異常，如微管蛋白突變等[3]；藥物作用靶點(diǎn)的改變，從而導(dǎo)致藥物起作用的細(xì)胞信號(hào)通路改變[4]；紫杉醇耐藥相關(guān)基因表達(dá)的異常[5]。

本研究中順鉑處理48h后，SKOV3、SKOV3-TR30加藥細(xì)胞與未加藥的細(xì)胞比較G0/G1期細(xì)胞均減少，且SKOV3的減少幅度大于SKOV3-TR30，說(shuō)明順鉑均可影響SKOV3、SKOV3-TR30細(xì)胞的周期，且對(duì)SKOV3的影響大于SKOV3-TR30。順鉑作用 24、36、48h，SKOV3、SKOV3-TR30細(xì)胞凋亡與之前相比明顯增多，且SKOV3凋亡細(xì)胞比例明顯高于SKOV3-TR30，說(shuō)明隨著順鉑作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)SKOV3和SKOV3-TR30細(xì)胞凋亡的影響越大，且對(duì)SKOV3細(xì)胞的凋亡作用大于SKOV3-TR30細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示SKOV3-TR30對(duì)順鉑存在一定耐藥性，這可能是由于細(xì)胞的多藥耐藥引起。

[1]林淑君,許慎,蔡友鵬.洛鉑聯(lián)合化療治療復(fù)發(fā)性卵巢癌的臨床觀察[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2011,17(6):65.

[2]張瑞平,董霖.卵巢癌患者應(yīng)用紫衫醇聯(lián)合卡鉑方案的觀察和護(hù)理[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2010,16(7):108-109.

[3]Xia W,Low PS.Folate-targeted therapies for cancer[J].J Med Chem,2010,53（19）:6811-6824.

[4]石云,段振玲,徐琳,等.順鉑誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3細(xì)胞自噬和凋亡的研究[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展,2011,20（1）:45-47.

[5]段愛紅,王輝,陳俊麗.洛鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞SKOV3凋亡的研究[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué),2009,9(7):1214-1215.