王一帆 程明亮 吳君

目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人群流行病學(xué)調(diào)查表明砷對(duì)肝臟有致?lián)p傷作用，可引起多種肝臟疾?。ǜ卫w維化、肝硬化及肝癌）[1-2]。且臨床觀察漢丹肝樂(lè)對(duì)砷中毒致肝損傷有保護(hù)作用，初步顯示較好療效[3]。本實(shí)驗(yàn)研究漢丹肝樂(lè)對(duì)砷暴露大鼠肝損傷的保護(hù)作用，了解其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SD大鼠80只，雌雄各半，體重（180～200）g，由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。SD大鼠隨機(jī)分成正常組、模型組、漢丹肝樂(lè)高、低劑量預(yù)防組，每組各20只。

試劑采用漢丹肝樂(lè)（主要成分丹參、赤芍、黃芪、漢防己堿、銀杏葉等），棕黃色粉末，貴陽(yáng)制藥廠生產(chǎn)。亞砷酸鈉，分析純，美國(guó)sigma公司產(chǎn)品。丙二醛測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶測(cè)定試劑盒、Trizol試劑均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。MT引物由上海生工生物工程有限公司合成。β-actin引物、逆轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈合成試劑盒、POWER SYBR Green PCR MASTER MIX由美國(guó)國(guó)家環(huán)境衛(wèi)生科學(xué)研究所劉杰博士惠贈(zèng)。甲醛、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等均為市售分析純。實(shí)驗(yàn)器材采用GeneAmp9700擴(kuò)增儀、GeneAmp5700實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增儀、Amersham Biosciences 2100核酸蛋白分析儀、SIGMA-3K30臺(tái)式冷凍離心機(jī)、上海菁華科技儀器有限公司752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、日本三洋-80℃低溫冰箱、水浴箱、低速離心機(jī)、微波爐等。

1.2 方法 正常組大鼠飲用自來(lái)水，模型組、漢丹肝樂(lè)高、低劑量預(yù)防組飲用亞砷酸鈉水，食用普通飼料。亞砷酸鈉水濃度，在實(shí)驗(yàn)前根據(jù)給藥方式、大鼠耐受情況，用不同濃度給大鼠飲用，最后選定100/L作為實(shí)驗(yàn)濃度。同時(shí)，用漢丹肝樂(lè)懸液給預(yù)防組大鼠灌胃，1次/d，高劑量預(yù)防組1g/kg體重、低劑量預(yù)防組0.5 g/kg體重。4周后每組大鼠隨機(jī)處死10只，取肝組織-80℃保存。12周后處死剩余大鼠并留取標(biāo)本（模型組、漢丹肝樂(lè)低劑量預(yù)防組各死亡2只）。

1.3 檢測(cè)指標(biāo) 按照相應(yīng)測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)肝組織勻漿MDA、SOD;抗氧化系統(tǒng)功能檢測(cè);Real-Time quantitative RT-PCR檢測(cè)MT基因的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用方差分析，分析前行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊時(shí)用LSD法，若方差不齊時(shí)用Tambane’s 法（q’檢驗(yàn)），P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 漢丹肝樂(lè)預(yù)防4周、12周時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組大鼠抗氧化系統(tǒng)受藥物的影響如表1、表2所示，漢丹肝樂(lè)預(yù)防4周，模型組和預(yù)防組大鼠肝臟MDA含量與正常組比較有所增加，SOD活性有所減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為1.475,0.228）。漢丹肝樂(lè)預(yù)防12周，低劑量預(yù)防組、模型組大鼠肝臟MDA含量較正常組明顯增加（F=5.449，P<0.05），SOD活性明顯減少（F=5.432，P<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高劑量預(yù)防組大鼠肝臟MDA含量較模型組明顯降低（F=5.449，P<0.05），SOD活性明顯增加（F=5.432，P<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 第4周各組大鼠肝臟MDA、SOD的變化()

表1 第4周各組大鼠肝臟MDA、SOD的變化()

注：與正常組比較，aP>0.05

組別 例數(shù) MDA（nmol/mgprot） SOD(U/mgprot)正常組 10 2.024±0.634 338.720±49.076模型組 10 2.291±3.028a 322.307±3.028a高劑量預(yù)防組 10 2.109±0.824a 312.623±46.092a低劑量預(yù)防組 10 2.568±1.091a 332.046±77.858a

表2 第12周各組大鼠肝臟MDA、SOD的變化()

表2 第12周各組大鼠肝臟MDA、SOD的變化()

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

組別 例數(shù) MDA（nmol/mgprot） SOD(U/mgprot)正常組 10 2.16±0.394 374.684±38.732模型組 8 4.551±2.672a 280.844±30.537a高劑量預(yù)防組 10 2.163±0.284b 343.38±52.740b低劑量預(yù)防組 8 3.759±0.790a 318.35±58.241a

2.2 漢丹肝樂(lè)預(yù)防4周、12周時(shí)，藥物對(duì)大鼠肝臟MT mRNA表達(dá)的影響 如表3、表4所示，漢丹肝樂(lè)預(yù)防4周和12周,模型組和低劑量預(yù)防組大鼠MT-mRNA表達(dá)較正常組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為16.495，19.917,P<0.05）。高劑量預(yù)防組大鼠MT-mRNA表達(dá)較模型組顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為 16.495，19.917,P<0.05）。

表3 第4周漢丹肝樂(lè)對(duì)各組大鼠肝臟MT mRNA表達(dá)的影響()

表3 第4周漢丹肝樂(lè)對(duì)各組大鼠肝臟MT mRNA表達(dá)的影響()

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 例數(shù) MT mRNA的相對(duì)表達(dá)水平正常組 10 91.77±3.67模型組 10 81.17±2.22a高劑量預(yù)防組 10 89.75±2.36b低劑量預(yù)防組 10 83.23±3.69a

表4 第12周漢丹肝樂(lè)對(duì)各組大鼠肝臟MT mRNA表達(dá)的影響()

表4 第12周漢丹肝樂(lè)對(duì)各組大鼠肝臟MT mRNA表達(dá)的影響()

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 例數(shù) MT-mRNA的相對(duì)表達(dá)水平正常組 10 80.09±2.27模型組 8 69.6±6.37a高劑量預(yù)防組 10 78.18±2.15b低劑量預(yù)防組 8 73.43±4.38a

3 討論

以往研究表明砷有致肝損傷作用。漢丹肝樂(lè)通過(guò)減少膠原合成及貯脂細(xì)胞增殖，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，減輕炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫等作用，從而保護(hù)肝細(xì)胞[4-8]。此實(shí)驗(yàn)想了解漢丹肝樂(lè)對(duì)砷暴露大鼠肝損傷的保護(hù)作用，探討藥物保護(hù)肝損傷的可能機(jī)制。

有研究發(fā)現(xiàn)氧化與抗氧化系統(tǒng)參與多種因素（CCL4、砷等）引起的肝損傷[9-10]。砷在體內(nèi)可以促進(jìn)自由基的生成，使膜脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，破壞膜結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，組織損傷。而當(dāng)體內(nèi)自由基增加時(shí)，機(jī)體會(huì)動(dòng)員抗氧化物質(zhì)來(lái)清除自由基，這樣就使得體內(nèi)的抗氧化物質(zhì)減少，抗氧化酶活性減低。砷對(duì)該系統(tǒng)的影響就是打破了機(jī)體氧化與抗氧化系統(tǒng)的平衡。在實(shí)驗(yàn)中漢丹肝樂(lè)預(yù)防4周，高、低劑量預(yù)防組MDA含量、SOD活性與模型組比較無(wú)明顯差異，預(yù)防12周高劑量預(yù)防組MDA含量較模型組明顯減少，SOD活性明顯增加，低劑量預(yù)防組與模型組比較MDA含量有所減少，SOD活性有所增加但不明顯，提示漢丹肝樂(lè)對(duì)砷暴露大鼠所致的氧化損傷有拮抗作用，此作用可能是通過(guò)藥物干預(yù)氧化與抗氧化系統(tǒng)而產(chǎn)生的。且高劑量預(yù)防組表現(xiàn)出的拮抗氧化損傷的作用趨勢(shì)更大。

金屬硫蛋白是一類(lèi)金屬含量高（通常4～12個(gè)金屬離子/分子）、富含半胱氨酸（20%～30%，有豐富的Cys－X－Cys序列結(jié)構(gòu)域）、缺乏芳香族氨基酸、組氨酸含量極少的低分子量（6000～7000D）金屬結(jié)合蛋白。研究[11-14]發(fā)現(xiàn)MT清除羥自由基的作用是體內(nèi)目前已知最強(qiáng)的，對(duì)肝細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)漢丹肝樂(lè)預(yù)防4周、12周模型組的MT-mRNA表達(dá)較正常組明顯降低，表明MT可能參與了砷致大鼠肝損傷的過(guò)程，有研究[15]顯示MT表達(dá)的降低可能是亞砷酸鈉肝毒性的一個(gè)易感因素。低劑量預(yù)防組MT-mRNA表達(dá)較正常組明顯降低，高劑量預(yù)防組MT-mRNA表達(dá)與正常組水平相當(dāng)，與模型組比較明顯增高，提示高劑量的漢丹肝樂(lè)可顯著誘導(dǎo)砷暴露大鼠肝臟表達(dá)MT-mRNA。MT表達(dá)缺乏后，肝臟對(duì)化學(xué)藥物、金屬毒物所致肝毒性的敏感性增高，MT表達(dá)增多的轉(zhuǎn)基因鼠則可對(duì)抗這種肝毒性，提示MT對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用[11-14]。漢丹肝樂(lè)誘導(dǎo)MT表達(dá)后，可能由于MT能有效的減輕肝臟的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，炎癥介質(zhì)的釋放，干預(yù)了肝損傷的發(fā)生。

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