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(1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津 300134； 2.北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心,北京 100097； 3.北京市農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)綜合發(fā)展研究所,北京 100097)

紫山藥低醇發(fā)酵飲料中乙醇含量的氣相色譜法測(cè)定

張紅雨1,宋曙輝2,周家華3,劉建福1,周連第3,*

(1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津 300134； 2.北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心,北京 100097； 3.北京市農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)綜合發(fā)展研究所,北京 100097)

建立了紫山藥低醇發(fā)酵飲料中乙醇含量的氣相色譜檢測(cè)方法。HP-INNOWAX(30m×0.25mm×25μm)毛細(xì)管柱為樣品分析柱時(shí),甲醇為樣品的稀釋劑；正丙醇可作為乙醇定量分析的內(nèi)標(biāo)物。甲醇、乙醇、正丙醇的出峰時(shí)間分別為2.909、3.110、3.846min,乙醇與正丙醇的分離度大于30。乙醇濃度在0.2～6.0mg/mL范圍時(shí),內(nèi)標(biāo)法測(cè)定的乙醇濃度與乙醇的峰面積的相關(guān)系數(shù)為0.9996,紫山藥樣品中乙醇的最低檢出限為0.05mg/mL。該測(cè)定方法的乙醇回收率在94.4%～107.4%之間,重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.23%,可滿足紫山藥低醇發(fā)酵飲料中乙醇含量的測(cè)定要求。

氣相色譜,紫山藥低醇飲料,乙醇

紫山藥(DioscoreaalataL.)是山藥中的一個(gè)特色品種,因其塊根紫色而得名。紫山藥塊根中含有大量的碳水化合物、蛋白質(zhì),還含有豐富的B族維生素、維生素C、粘蛋白、花青素、薯蕷皂等生理活性成分[1-4]。粘蛋白、花青素、薯蕷皂分別具有阻止血脂在血管壁的沉淀、抑制低密度脂蛋白(LDL)氧化、提高體內(nèi)雌雄激素水平升高等生理功能,因此,經(jīng)常食用紫山藥可以降低心血管疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)、延緩衰老、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等作用[5-6]。低醇發(fā)酵飲料是在保留果蔬汁原有營(yíng)養(yǎng)的同時(shí),運(yùn)用生物發(fā)酵技術(shù)賦予其一定的發(fā)酵風(fēng)味,并將乙醇的含量控制在較低水平的果蔬汁飲料[7-8]。紫山藥中的淀粉經(jīng)過(guò)糖化、發(fā)酵可以轉(zhuǎn)化成酒精,發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生濃郁的發(fā)酵香氣。作者通過(guò)控制酒精發(fā)酵程度生產(chǎn)了低醇、花青素、薯蕷皂等多種生物活性物質(zhì)的功能性紫山藥飲料?？焖?、準(zhǔn)確測(cè)定低醇發(fā)酵飲料中乙醇含量是實(shí)現(xiàn)低醇飲料可控發(fā)酵的關(guān)鍵。乙醇含量的測(cè)定方法較多,比重法常用于測(cè)定乙醇含量較高的樣品如酒等。AOAC推薦采用重鉻酸鉀氧化法測(cè)定乙醇的含量。最近,Jonathan R. Dion報(bào)道了超聲頻率分析方法測(cè)定飲料中乙醇的含量[9],但該法需要寬頻超能換聲器,應(yīng)用受到限制。氣相色譜具有快速、準(zhǔn)確、能測(cè)定樣品中的微量成分等特點(diǎn),為此,本文研究了低醇發(fā)酵飲料中乙醇含量的氣相色譜檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

紫山藥低醇發(fā)酵飲料 自制；乙醇 色譜純,CAS：64-17-5,西隴化工股份有限公司；甲醇 色譜純,CAS：67-56-1,北京化工廠；正丙醇 色譜純,CAS：71-23-8,天津市津科精細(xì)化工研究所。

Agilent 7890A氣相色譜儀、FID檢測(cè)器 美國(guó)AGILENT公司,Chemstation 化學(xué)工作站；7683B自動(dòng)進(jìn)樣器 美國(guó)AGILENT公司；AG-1602型空氣泵 北京科普生分析科技有限公司；HG-1803型高純氫氣發(fā)生器 北京科普生分析科技有限公司；HZ050R離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科貿(mào)工有限公司；FB-10T溶劑過(guò)濾瓶 杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司；LP503電子天平 精確至0.001g,常熟市衡器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 將發(fā)酵后的樣品在6000r/min轉(zhuǎn)速下離心5min,得上清液,再將上清液抽真空過(guò)0.45μm微孔濾膜,置冰箱備用。取待測(cè)樣品10mL于50mL容量瓶中,甲醇定容,再將待測(cè)定液在3000r/min下離心10min后過(guò)0.45μm有機(jī)濾膜,備用。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：HP-INNOWAX毛細(xì)管柱(30m×0.25mm×25μm)；FID檢測(cè)器溫度220℃,氫氣流速為40mL/min,空氣流速400mL/min,尾吹(N2)流速30mL/min；進(jìn)樣口溫度200℃,分流比為20∶1；柱流速為1mL/min；柱溫平衡時(shí)間0.5min,程序升溫60℃(保持1min),以10℃/min升至120℃(保持1min)；進(jìn)樣量1μL。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與曲線繪制 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取乙醇10g(精確至0.001g)于100mL容量瓶中,用甲醇定容,得到濃度為100mg/mL儲(chǔ)備液,置冰箱保存。外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：分別準(zhǔn)確量取0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、3.0mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于50mL容量瓶中,用甲醇定容,得到一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、4.0、6.0mg/mL。內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取正丙醇10g(精確至0.001g)于100mL容量瓶中,用甲醇定容,得到濃度為100mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液,置冰箱保存。內(nèi)標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：與外標(biāo)法取相同標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,再分別加內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液0.5mL,用甲醇定容,得到相同的標(biāo)準(zhǔn)溶液,其中內(nèi)標(biāo)正丙醇的濃度為1mg/mL。將配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液置冰箱保存待用,按照上述色譜條件進(jìn)行GC測(cè)定。

1.2.4 樣品分析 在相同的氣相色譜條件下,將標(biāo)準(zhǔn)溶液過(guò)0.45μm有機(jī)濾膜后進(jìn)行測(cè)定。以保留時(shí)間定性,外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法兩種方法進(jìn)行定量,并選取最佳的定量方法來(lái)定量樣品中乙醇的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1稀釋劑的選擇

在樣品稀釋時(shí),常用高純水作為稀釋劑。實(shí)驗(yàn)采用HP-INNOWAX毛細(xì)管柱,如果水作為稀釋劑,由于水的膨脹系數(shù)很大,一般要求進(jìn)樣量在0.5μL以下,且進(jìn)樣口與FID的溫度達(dá)到200℃以上,否則會(huì)造成毛細(xì)管柱的固定液的流失,減少柱子的使用壽命。為此選用甲醇作為樣品的稀釋劑,可以避免對(duì)毛細(xì)管柱的危害,同時(shí)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甲醇與乙醇的分離度大于2,有很好的分離效果(見(jiàn)圖1)。

2.2內(nèi)標(biāo)物的選擇

在分析乙醇含量時(shí),常用的內(nèi)標(biāo)物有甲醇、丙醇、丁醇以及乙酸正丁酯等。不同的樣品采用不同的內(nèi)標(biāo)物,本文采用正丙醇作為乙醇的內(nèi)標(biāo)物,主要是考慮到：樣品中不含有正丙醇；正丙醇結(jié)構(gòu)與被測(cè)組分乙醇相似；不與乙醇發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；乙醇與正丙醇有很好的分離效果,實(shí)驗(yàn)中多次測(cè)試(n=8),其分離度均大于30。如圖1、圖2所示。

圖1 未加內(nèi)標(biāo)物的樣品圖

圖2 加內(nèi)標(biāo)物的樣品圖

2.3定性分析

采用保留時(shí)間法定性,在上述的色譜條件下,進(jìn)1μL樣品所得色譜圖,進(jìn)樣后甲醇在2.909min時(shí)出峰,乙醇在3.110min時(shí)出峰,正丙醇在3.846min出峰,見(jiàn)圖3。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)

表2 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

表3 回收率實(shí)驗(yàn)

圖3 樣品色譜圖

2.4定量分析

按照上述的色譜條件測(cè)定乙醇的標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別用外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析(見(jiàn)圖4和圖5)。乙醇濃度在0.2～6.0mg/mL范圍內(nèi),采用外標(biāo)法定量可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2為0.9828；采用內(nèi)標(biāo)法定量可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2在0.999以上,為此樣品定量分析選用內(nèi)標(biāo)法。同時(shí)將紫山藥樣品經(jīng)過(guò)前處理后測(cè)定,以3倍信噪比計(jì)算出儀器的檢出限為0.01mg/mL。因?yàn)闃悠吩跈z測(cè)前被稀釋了5倍,所以紫山藥樣品中乙醇的最低檢出限為0.05mg/mL。

圖4 外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖5 內(nèi)標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.5方法學(xué)考察

2.5.1 精密度實(shí)驗(yàn) 在確定的色譜條件下,將樣品過(guò)0.45μm有機(jī)濾膜并連續(xù)測(cè)定6次,進(jìn)行精密度考察。結(jié)果顯示,精密度實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.278%,表明該方法具有很好的精密度。

2.5.2 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取同一批6份發(fā)酵后的樣品,進(jìn)行樣品處理作重復(fù)性考察。結(jié)果顯示,重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.23%,這表明此檢測(cè)方法有較好的重現(xiàn)性。

2.5.3 回收率實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)備已知濃度的飲料樣品,分別加入不同體積的乙醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,按照上面的GC方法做加樣回收率實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示該方法的回收率在94.4%～107.4%之間,表明氣相色譜法能較好的測(cè)定乙醇的含量。

3 結(jié)論

采用HP-INNOWAX毛細(xì)管柱,選擇甲醇作為樣品的稀釋劑,正丙醇為定量測(cè)定乙醇的內(nèi)標(biāo)物,三者之間有較好的分離度,從而確定了內(nèi)標(biāo)法的定量方法。內(nèi)標(biāo)法定量具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)在0.999以上。同時(shí)得到樣品中乙醇的最低檢出限為0.05mg/mL,重現(xiàn)性和精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%,回收率在94.4%～107.4%之間。本方法定性、定量準(zhǔn)確,可靠,準(zhǔn)確度和回收率較高,可用于低醇發(fā)酵飲料中乙醇含量的測(cè)定。

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Determination of alcohol in purple yam low-alcohol fermented beverage by gas chromatography

ZHANGHong-yu1,SONGShu-hui2,ZHOUJia-hua3,LIUJian-fu1,ZHOULian-di3,*

(1.Institute of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce,Tianjin 300134,China; 2.Beijing Vegetable Research Center of BAAFS,Beijing 100097,China; 3. Institute of Agricultural Integrated Development of BAAFS,Beijing 100097,China)

A method for gas chromatography determinnation of alcohol content in purple yam low-alcohol femented beverages was reported in this paper. The samples were separated on HP-INNOWAX(30m×0.25mm×25μm)capillary column. Methanol was chosen as the diluent and the n-propanol was used as the standard substance. Results showed that the peak time of methanol,ethanol and n-propanol was 2.909,3.110 and 3.846min,respectively. And the degree of separation for ethanol and n-propanol was more than 30. The linear range was 0.2～6.0mg/mL with a correlation of 0.9996,and the detection limits were 0.05mg/mL for alcohol in purple yam. Recoveries varied from 94.4%～107.4%,and the relative standard deviation(RSD)of the repetitive experimental was 4.23%. This method developed could be used to detect alcohol content in purple yam low-aocohol femented beverages.

gas chromatography;purple yam low-alcohol beverages;alcohol

2013-05-20 *通訊聯(lián)系人

張紅雨(1989-),女,在讀碩士研究生,研究方向：發(fā)酵工程。

北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項(xiàng)。

TS278

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