,,,,

(中國(guó)科學(xué)院藏藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所,青海西寧 810008)

柴達(dá)木盆地不同生長(zhǎng)期菊芋葉片綠原酸含量變化規(guī)律研究

岳會(huì)蘭,畢宏濤,于瑞濤,張本印,陶燕鐸*

(中國(guó)科學(xué)院藏藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所,青海西寧 810008)

本研究以柴達(dá)木盆地不同生長(zhǎng)期菊芋葉片為研究材料,建立了菊芋葉片綠原酸HPLC快速定量檢測(cè)方法,并對(duì)柴達(dá)木盆地菊芋葉片綠原酸含量隨生長(zhǎng)期變化規(guī)律進(jìn)行研究。在選擇流動(dòng)相時(shí),本文對(duì)測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化,獲得了較好的分離度,并進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。對(duì)不同采集時(shí)間菊芋葉片綠原酸含量測(cè)定結(jié)果表明,不同生長(zhǎng)期菊芋葉片綠原酸含量差異顯著,最高月份含量可達(dá)到最低月份含量的2倍,8月1日至10月15日菊芋葉片綠原酸含量呈上升趨勢(shì),至10月15日達(dá)到最高(葉片干重的0.83%),隨后逐漸降低。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,柴達(dá)木地區(qū)作為綠原酸提取原料的菊芋葉片采收期以10月15日左右為宜。

菊芋,綠原酸,含量,變化規(guī)律

菊芋(HelianthustuberosusL.),屬菊科向日葵屬多年生宿根草本植物,因其地上似菊,地下為芋而得名,俗名洋姜、鬼子姜等。原產(chǎn)自北美洲,于17世紀(jì)傳入歐洲,后傳入伊朗、中國(guó)和日本。全球的熱帶、溫帶、寒帶以及干旱、半干旱地區(qū)都有菊芋的分布[1]。近幾年,我國(guó)對(duì)能源植物的開發(fā)和利用極大地促進(jìn)了菊芋的大面積種植及開發(fā)項(xiàng)目的啟動(dòng),需求量日趨增大,逐漸形成了很多較為規(guī)范化、規(guī)?；木沼蠓N植園區(qū)和深度開發(fā)項(xiàng)目,并形成了規(guī)模日趨擴(kuò)大的較為完整的“菊芋塊莖種植加工產(chǎn)業(yè)”鏈。但在菊芋產(chǎn)業(yè)鏈中,菊芋地上部分的利用程度不高。綠原酸(Chlorogenic acid)類化合物廣泛存在于植物中,是植物體在有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物,為多酚類化合物,是菊芋的重要生理活性成分[2-3],具有降壓、利膽、清除自由基、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老等多種藥理學(xué)功能[4-5]。目前,醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中所需的綠原酸主要來(lái)源于金銀花和杜仲的葉片中[6-7],而菊芋葉片綠原酸的研究還處于起步階段[8-10]。因此,為了明確菊芋葉片綠原酸含量變化規(guī)律,更好的將其應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域,本研究將建立HPLC菊芋葉片綠原酸快速定量檢測(cè)方法,并對(duì)柴達(dá)木盆地菊芋葉片綠原酸含量隨生長(zhǎng)期變化規(guī)律進(jìn)行研究,以期為菊芋葉片中綠原酸的高效利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

菊芋品種J1 由蘭州大學(xué)劉建全教授課題組提供；菊芋葉片采集于青海省海西蒙古族藏族自治州都蘭縣西河灘村菊芋種植基地(海拔2830m；N36.386,E98.024),分別于2012年8月至11月期間每月1日和15日采集7份樣本(樣本編號(hào)：QHDL-1、QHDL-2、QHDL-3、QHDL-4、QHDL-5、QHDL-6和QHDL-7),洗凈后低溫烘干備用；綠原酸對(duì)照品 購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢測(cè)所；乙腈為色譜純 山東禹王；其它試劑均為分析純。

Agilent 1200高效液相色譜儀,紫外檢測(cè)器Agilent化學(xué)工作站 美國(guó)安捷倫公司;UPT-I-5超純水機(jī) 成都超純科技有限公司；AG204電子分析天平 梅特勒公司；烘箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；WP800SL23-2微波實(shí)驗(yàn)儀 南京匯研微波系統(tǒng)工程有限公司。

1.2色譜條件

色譜柱：Dikma SynerSi 4u Fusion-RP 80R 250×4.6mm 4 micron；柱溫：30℃；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：327nm；流動(dòng)相：0.2%磷酸∶乙腈=82∶18；進(jìn)樣量10μL。

1.3對(duì)照品溶液制備

用精密稱取綠原酸對(duì)照品10mg,用60%乙醇溶解并定容于50mL容量瓶,搖勻,得到0.2mg/mL儲(chǔ)備液。再分別稀釋到0.1、0.08、0.06、0.04、0.02mg/mL和0.01mg/mL,用60%乙醇定容于25mL容量瓶搖勻待用。

1.4菊芋葉片綠原酸待測(cè)溶液制備

各樣品分別取菊芋葉片烘干、粉碎,過80目篩。精密稱取粉碎的菊芋葉片1g(3份),加入20mL 60%乙醇,微波回流提取2次,每次25min,合并濾液,定容至50mL。將提取液過0.45μm濾膜,作為樣品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1線性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照品溶液10μL注入高效液相色譜儀,測(cè)定其峰面積,見圖1。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y),樣品重量(μg)為橫坐標(biāo)(X),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果表明綠原酸在0.1～1.0μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系?；貧w方程為y=1503.3x+183.62,相關(guān)系數(shù)R2為0.9994。

圖1綠原酸對(duì)照品(A)和菊芋葉樣品(B)HPLC圖譜

2.2精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液10μL注入高效液相色譜儀,重復(fù)進(jìn)樣6次,測(cè)定其峰面積,RSD為0.291%,精密度良好,結(jié)果見表1。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)

2.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取上述對(duì)照品溶液,每隔4h進(jìn)樣,每次進(jìn)樣10μL,測(cè)定其峰面積,結(jié)果表明在24h內(nèi)綠原酸基本穩(wěn)定,結(jié)果見表2。

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.4重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精確稱取QHDL-6樣品6份,依1.5方法制備樣品溶液,每次進(jìn)樣10μL,分別在相同條件下測(cè)定綠原酸的含量,結(jié)果見表3,QHDL-6樣品的平均含量為0.829%,RSD=0.366%,結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

2.5加樣回收率實(shí)驗(yàn)

在樣品中加入一定濃度的綠原酸對(duì)照品溶液,按“樣品測(cè)定溶液的制備”項(xiàng)下操作,在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定,分別計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見表4,綠原酸的平均回收率為96.4%,RSD=0.871%。

表4 綠原酸回收率

2.6樣品含量的測(cè)定

分別稱取菊芋葉片粉末,按“1.5”的方法制備供試液,測(cè)定含量,結(jié)果見表5。

表5 菊芋葉片材料編號(hào)與采集日期及其綠原酸含量

注：表中p值表示該采集日期與前一日期含量比較的差異顯著性。

對(duì)樣品綠原酸含量的測(cè)定結(jié)果顯示,柴達(dá)木地區(qū)菊芋葉片綠原酸含量隨其生長(zhǎng)期變化明顯。菊芋葉片綠原酸含量從8月1日干重的0.42%增長(zhǎng)到10月15日的0.83%,隨后下降至11月1日的0.73%。而10月1日至11月1日期間,正是菊芋塊莖的關(guān)鍵膨大期,塊莖增重明顯,其中10月15日至11月1日期間,柴達(dá)木地區(qū)氣溫驟降,地上部分逐漸失水,至11月1日后,葉片完全失水變脆。地上部分綠原酸類化合物的合成可能與其塊莖的膨大有一定的關(guān)系。

3 結(jié)論

本研究在選擇流動(dòng)相時(shí),參照張海娟等[10]的測(cè)定條件,并進(jìn)行了優(yōu)化,降低了甲醇-水-磷酸體系中磷酸濃度。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果本實(shí)驗(yàn)選擇0.2%的磷酸為流動(dòng)相條件,不僅可以減少高濃度磷酸對(duì)柱填料的傷害,同時(shí)也能獲得較好的分離度。此外,采用峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y),樣品重量(μg)為橫坐標(biāo)(X)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,避免進(jìn)樣體積對(duì)含量測(cè)定的影響。

對(duì)不同采集時(shí)間菊芋葉片綠原酸含量測(cè)定結(jié)果表明,不同生長(zhǎng)期菊芋葉片綠原酸含量差異顯著,8月1日至10月15日菊芋葉片綠原酸含量呈上升趨勢(shì),至10月15日達(dá)到最高(葉片干重的0.83%),隨后逐漸降低。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明,柴達(dá)木地區(qū)作為綠原酸提取原料的菊芋葉片采收時(shí)期以10月15日左右為宜。目前還沒有文獻(xiàn)報(bào)道過菊芋葉片中綠原酸隨時(shí)間變化規(guī)律的研究,尤其是青海產(chǎn)菊芋葉片中綠原酸的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。本研究對(duì)青海產(chǎn)菊芋葉片中綠原酸的采收和高效利用提供了重要的理論指導(dǎo)。

[1]Stanley JK,Stephen FN. Biology and Chemistry of Jerusalem Artichoke[M]. New York:CRC Press,2008,55.

[2]Tchone M,Barwald G,Annemuller G,etal. Separation and identification of phenolic compounds in Jerusalem artichoke(Helianthus tuberosus L.)[J]. Science Des Aliments,2006,26(5):394-408.

[3]Jaiswal R,Deshpande S,Kuhnert N. Profiling the chlorogenic acids of Rudbeckia hirta,Helianthus tuberosus,Carlina acaulis and Symphyotrichum novae-angliae leaves by LC-MSn[J]. Phytochemical Analysis,2011,22(5):432-441.

[4]Zhao YY,Wang JK,Ballevre O,etal. Antihypertensive effects and mechanisms of chlorogenic acids[J]. Hypertension Research,2012,35(4):370-374.

[5]Mubarak A,Bondonno CP,Liu AH,etal. Acute effects of chlorogenic acid on nitric oxide status,endothelial function,and blood pressure in healthy volunteers:a randomized trial[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2012,60(36 SI):9130-9136.

[6]蘭小艷,張學(xué)俊,龔桂珍. 杜仲葉中綠原酸的研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2009,25(21):86-89.

[7]羅磊,郭曉園. 金銀花中綠原酸的研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工,2008,8:60-62.

[8]袁曉艷,高明哲,王鍇，等. 高效液相色譜-質(zhì)譜法分析菊芋葉中的綠原酸類化合物[J]. 色譜,2008,l26(3):335-338.

[9]張海娟,劉玲,鄭曉濤，等. 菊芋葉片綠原酸的提取工藝條件優(yōu)化研究[J]. 食品工業(yè)科技,2011,32(5):261-265.

[10]張海娟,黃增榮,隆小華，等. HPLC法測(cè)定不同品種不同產(chǎn)地菊芋葉片中綠原酸的含量[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2011,23(5):1107-1109.

Research of the contents variation of chlorogenic acid in the leaves ofHelianthustuberosusL. during different growth stages in Chaidamu

YUEHui-lan,BIHong-tao,YURui-tao,ZHANGBen-yin,TAOYan-duo*

(Key Laboratory of Tibetan Medicine Research,Northwest Institute of Plateau Biology, Chinese Academy of Sciences,Xining 810008,China)

In this study,the rapid HPLC quantitative detection method of chlorogenic acid,and the contents variation of chlorogenic acid in the leaves ofHelianthustuberosusL. during different growth stages in Chaidamu were studied. In the choice of the mobile phase,the determination conditions were optimized,and obtained a better resolution. In addition,the standard curveand was carried out. The results showed that the chlorogenic acid contents in the leaves ofHelianthustuberosusL. during different growth stages had significant differences. The chlorogenic acid contents in the leaves ofHelianthustuberosusL. during August 1st to October 15th had an upward trend,and the highest content was reached on October 15th. The above experimental data indicated that the harvest period ofHelianthustuberosusL. should be determined around the October 15th.

HelianthustuberosusL.;chlorogenic acid;content;variation

2013-07-15 *通訊聯(lián)系人

岳會(huì)蘭(1981-),女,博士,助理研究員,主要從事藥物化學(xué)及新藥研發(fā)。

青海省省科技廳“菊芋適宜性栽培技術(shù)研究”(2011-N-515)。

TS201.2

：A

：1002-0306(2014)01-0283-03