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(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640)

食源性沙門氏菌第Ⅰ類整合子檢測及其耐藥基因盒分析

周蓉,李琳,蘇健裕*,李冰,徐振波

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640)

目的:了解食源性沙門氏菌的耐藥性、Ⅰ類整合子分布及其耐藥基因盒的結(jié)構(gòu)序列,為Ⅰ類整合子的分子進(jìn)化提供理論基礎(chǔ)。方法：采用K-B紙片法檢測食源性沙門氏菌對14種抗生素的敏感性；利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增整合酶基因intI1檢測食源性沙門氏菌中Ⅰ類整合子攜帶率及可變區(qū)耐藥基因盒。結(jié)果：食源性沙門氏菌對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類和磺胺類的最高耐藥率分別為18.75%、12.5%、6.25%和25%。59.4%(19/32)的食源性沙門氏菌檢測出第Ⅰ類整合子。PCR 擴(kuò)增Ⅰ類整合子耐藥基因盒,擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1009和1664bp,攜帶aadA5、dfr17和aadA2耐藥基因,可分別介導(dǎo)對氨基糖苷類抗生素壯觀霉素、鏈霉素和磺胺類藥物甲氧芐氨嘧啶的耐藥。結(jié)論：食源性沙門氏菌中也檢測到較高的耐藥率及整合子攜帶率,提示我們應(yīng)該從基因水平上對食源性致病菌耐藥及其傳播進(jìn)行監(jiān)測。

沙門氏菌,第Ⅰ類整合子,耐藥基因盒,耐藥性

沙門氏菌(Salmonella)廣泛分布于自然界,能夠引起食源性感染,是對人類和動(dòng)物健康有極大危害的一類致病菌。沙門氏菌是引起腹瀉的重要病原微生物之一,據(jù)統(tǒng)計(jì),我國細(xì)菌性食物中毒中,有70%～80%是由沙門氏菌引起的[1]。近年來,世界各國都加強(qiáng)了食品安全工作,但是食品安全問題還是層出不窮。一方面食品生產(chǎn)是一個(gè)時(shí)間長、環(huán)節(jié)多的復(fù)雜過程,在整個(gè)過程中存在著許許多多被致病性微生物污染的可能性；另一方面,隨著越來越多食品生產(chǎn)者在生產(chǎn)源頭上濫用各種抗菌藥物,造成了致病性微生物耐藥菌株的大量出現(xiàn),使得致病性微生物耐藥性不斷增強(qiáng),并廣泛傳播。不斷蔓延的細(xì)菌耐藥(Bacterial Resistance)問題已成為食品安全重大隱患之一,對人類的生命和健康構(gòu)成了巨大的威脅。因此,系統(tǒng)地分析食源性細(xì)菌的耐藥性,對了解和解決細(xì)菌感染等食品安全事件具有重要作用。在對細(xì)菌耐藥機(jī)制的探討中,整合子系統(tǒng)介導(dǎo)的細(xì)菌耐藥調(diào)控機(jī)制引起了廣泛的關(guān)注[2]。整合子是細(xì)菌基因組中一種介導(dǎo)耐藥基因轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)座元件,其功能與耐藥基因的產(chǎn)生密切相關(guān)[3-4]。典型的整合子結(jié)構(gòu)由保守區(qū)和可變區(qū)組成,保守區(qū)是整合酶編碼基因的所在區(qū)域,可變區(qū)是由耐藥基因盒組成；其中最常見的整合子為Ⅰ類整合子。關(guān)于Ⅰ類整合子結(jié)構(gòu)、耐藥基因盒的捕獲及表達(dá),相關(guān)的研究報(bào)道較多[5-8]。相關(guān)研究結(jié)果表明,Ⅰ類整合子可以攜帶至少數(shù)十種耐藥基因盒,所含耐藥基因幾乎覆蓋了臨床上所有使用的抗生素[9]。然而,前期的研究多集中在臨床菌株的研究,對食源性致病菌的報(bào)道較少。本研究對從超市食品樣品中分離得到32株食源性沙門氏菌中第Ⅰ類整合子的分布及其整合的耐藥基因盒進(jìn)行了檢測并分析其耐藥基因,進(jìn)一步探討了整合子在食源性致病菌耐藥中的介導(dǎo)作用,從基因角度研究了這些菌株的耐藥性,為食源性致病菌安全控制技術(shù)的實(shí)施提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

沙門氏菌 均分離于廣州地區(qū)超市零售食物中,菌株來源見表1；第Ⅰ類整合子陽性對照菌株P(guān)seudomonasaeruginosaPAH15 本實(shí)驗(yàn)室保藏；第Ⅰ類整合子陰性對照菌株為對利福平耐藥的含有pET196質(zhì)粒大腸桿菌RG488 本實(shí)驗(yàn)室保藏；藥敏實(shí)驗(yàn)質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC25922 本實(shí)驗(yàn)室保存；藥敏實(shí)驗(yàn)質(zhì)控菌株銅綠假單胞菌ATCC27853 本實(shí)驗(yàn)室保存；OMEGA Kits 試劑盒 飛揚(yáng)生物公司；DNA Marker DGL5000,10×Loading Buffer,2×Taq Master Mix NEW ENGLAND BioLabs；14種抗生素分別為頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢曲松、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南、慶大霉素、阿米卡星、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林/克拉維酸、頭孢哌酮/舒巴坦 北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株來源

注：本實(shí)驗(yàn)研究的沙門氏菌(S1-S32)均由廣東檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心惠贈(zèng)。

磁珠提取DNA系統(tǒng)RS-232C Thermo公司；PCR儀、凝膠成像分析系統(tǒng)UNIVERSAL HOOD Ⅱ 美國BIO-RAD儀器有限公司；瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)GE-100 HANGZHOU BIOER公司。

1.2藥敏檢測

采用選取的14種抗生素對食源性沙門氏菌進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)步驟參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)紙片擴(kuò)散法(K-B紙片法)標(biāo)準(zhǔn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷采用美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)[10]。

1.3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)篩選第Ⅰ類整合子陽性沙門氏菌

1.3.1 DNA模板的制備和引物的設(shè)計(jì)

1.3.1.1 沙門氏菌DNA的提取 參考文獻(xiàn)[11]的方法。

1.3.1.2 引物設(shè)計(jì) 參考文獻(xiàn)[6]的方法。分別用來擴(kuò)增整合酶基因intI1、耐藥基因盒和3′CS。引物序列見表2。

表2 引物序列

注：引物由invitrogen公司合成。

1.3.2 PCR反應(yīng)檢測第Ⅰ類整合子陽性沙門氏菌 用PCR儀檢測第Ⅰ類整合子,登陸國際生物信息庫GenBank,50μL PCR反應(yīng)體系,擴(kuò)增程序參照文獻(xiàn)[6],產(chǎn)物分析采用含有EB(溴化乙錠)的瓊脂-糖凝膠電泳方法,凝膠成像系統(tǒng)成像檢測。以銅綠假單胞菌 PAH15為第Ⅰ類整合子陽性對照菌,以對利福平耐藥且含有pET196質(zhì)粒的大腸桿菌RG488為第Ⅰ類整合子陰性對照菌,對食源性沙門氏菌進(jìn)行第Ⅰ類整合酶基因intI1擴(kuò)增,出現(xiàn)陽性結(jié)果則判為第Ⅰ類整合子陽性菌株。

1.4耐藥基因盒擴(kuò)增產(chǎn)物的純化、測序和序列分析

以第Ⅰ類整合子陽性沙門氏菌作為實(shí)驗(yàn)菌株,制備DNA 模板和設(shè)計(jì)引物[6],PCR 反應(yīng)體系和PCR擴(kuò)增程序均與1.3.1相同,上海美吉公司完成PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測序過程。應(yīng)用DNAMAN軟件對耐藥基因盒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA序列進(jìn)行開放讀碼框(ORF)分析,登陸美國國家生物技術(shù)信息中心DNA數(shù)據(jù)庫GenBank,進(jìn)行DNA序列同源性比對分析。

1.5限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)

利用DNASIS軟件確定限制性內(nèi)切酶,對特異性引物in-F、in-B擴(kuò)增出的相同片段進(jìn)行酶切反應(yīng)。酶切反應(yīng)體系組成為8μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,2μL酶緩沖液,1μL內(nèi)切酶,10μL無菌去離子水,將其置于37℃恒溫條件下反應(yīng),1h后加入3μL 10×Loading Buffer終止反應(yīng),用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1菌株藥敏檢測結(jié)果

表3 食源性沙門氏菌藥敏檢測結(jié)果

注：S表示敏感,I表示中度敏感,R表示耐藥。

根據(jù)NCCLS推薦的標(biāo)準(zhǔn),檢測了32株食源性沙門氏菌對14種抗生素的敏感性。本實(shí)驗(yàn)所檢測的食源性沙門氏菌對頭孢曲松、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南、頭孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星都敏感；對磺胺類藥物復(fù)方新諾明的耐藥率最高,達(dá)到25.00%；對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類和喹諾酮類都有部分耐藥性。結(jié)果表明,食源性沙門氏菌對臨床使用的抗菌藥物具有一定的多重耐藥性,且細(xì)菌的多重耐藥性一般與Ⅰ類整合子密切相關(guān)[4]。32株食源性沙門氏菌對檢測的14種抗生素的耐藥性見表3。

由表3可知,食源性沙門氏菌對檢測的14種抗生素耐藥率相對較低,均低于30%,但是對四大類抗生素均有耐藥。β-內(nèi)酰胺類最高耐藥率達(dá)到18.75%,氨基糖苷類達(dá)到12.50%,喹諾酮類達(dá)到6.25%,磺胺類達(dá)到25.00%。

2.2第Ⅰ類整合子陽性沙門氏菌檢測結(jié)果

陽性沙門氏菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠成像見圖1。由圖1可知,32株食源性沙門氏菌中,用上游引物int-U、下游引物int-D擴(kuò)增整合酶基因intI1,共有19株沙門氏菌得到了923bp的擴(kuò)增產(chǎn)物,和預(yù)測擴(kuò)增產(chǎn)物片斷大小相符,推測可能為第Ⅰ類整合子陽性菌株,同時(shí)對其片斷進(jìn)行純化,測序分析結(jié)果表明與923bp大小intI1(Y18050)100%同源,確認(rèn)為intI1。沙門氏菌第Ⅰ類整合子陽性菌：S1、S3、S4、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S13、S15、S17、S19、S20、S21、S27、S28、S29、S30；第Ⅰ類整合子陽性檢出率為59.4%。

圖1 特異性引物int-U和int-D 擴(kuò)增整合酶基因intI1 PCR產(chǎn)物部分電泳結(jié)果

圖2 特異性引物in-F和in-B 擴(kuò)增第Ⅰ類整合子陽性菌PCR產(chǎn)物部分電泳結(jié)果

2.3耐藥基因盒擴(kuò)增序列分析

用in-F和in-B特異性引物擴(kuò)增第Ⅰ類整合子陽性菌整合的耐藥基因盒,結(jié)果表明,共有14株(74%)有擴(kuò)增產(chǎn)物,分別是S1、S3、S4、S6、S7、S8、S13、S15、S17、S19、S20、S21、S27、S30；其余5株沙門氏菌未見有擴(kuò)增產(chǎn)物,可能是并未捕獲耐藥基因或者耐藥基因未表達(dá)。PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖2,擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1009bp和1664bp。2株菌S6和S15擴(kuò)增得到1664bp PCR產(chǎn)物,對其一片段進(jìn)行測序,序列分析表明該片段(AB189264)含有2個(gè)開放閱讀框,大小分別為474bp和789bp,與耐藥基因盒aadA5和dfr17 100%同源,分別對氨基糖苷類抗生素壯觀霉素、鏈霉素和磺胺類藥物甲氧芐氨嘧啶產(chǎn)生耐藥。所有菌株擴(kuò)增得到1009bp PCR產(chǎn)物,對其一片段進(jìn)行測序,序列分析表明該片段(FJ594765.1)與耐藥基因盒aadA2 100%同源,介導(dǎo)對氨基糖苷類抗生素、鏈霉素產(chǎn)生耐藥。另外,從2株菌S6和S15同時(shí)擴(kuò)增出1664bp和1009bp的PCR產(chǎn)物,其序列分析與前述相同。

2.4耐藥基因盒長度多態(tài)性分析結(jié)果

用特異性內(nèi)切酶對1664bp和1009bp耐藥基因盒進(jìn)行酶切,特異性引物in-F、in-B擴(kuò)增結(jié)果表明,2個(gè)1664bp片段都含有aadA5和dfr17耐藥基因,所有1009bp片段都含有aadA2耐藥基因,酶切結(jié)果見表4。用qacEΔ1-F和Sul1-B擴(kuò)增以上19株第Ⅰ類整合子陽性沙門氏菌的3′CS,擴(kuò)增產(chǎn)物均為800bp,和文獻(xiàn)[13]一致。說明19株陽性沙門氏菌的3′CS是完整的。耐藥基因盒結(jié)構(gòu)示意圖見圖3。

表4 耐藥基因盒酶切結(jié)果

圖3 耐藥基因盒結(jié)構(gòu)示意圖

3 討論

近年來,整合子介導(dǎo)的細(xì)菌耐藥成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。然而,目前整合子研究報(bào)道主要集中在臨床菌株[14-15]。本實(shí)驗(yàn)從基因角度研究分離自食品的沙門氏菌其整合子介導(dǎo)的細(xì)菌耐藥性。檢測到第Ⅰ類整合子陽性菌株所占比例為59.4%。PCR特異性擴(kuò)增第Ⅰ類整合子陽性菌株的耐藥基因盒,14株均有擴(kuò)增產(chǎn)物且片段大小分別為1009bp和1664bp。2株中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為1664bp,攜帶aadA5和dfr17基因,編碼介導(dǎo)氨基糖苷類抗生素壯觀霉素、鏈霉素和磺胺類藥物甲氧氨芐嘧啶耐藥的基因。14株中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為1009bp,攜帶aadA2基因,編碼介導(dǎo)氨基糖苷類抗生素壯觀霉素、鏈霉素耐藥的基因。2株菌同時(shí)擴(kuò)增得到1009和1664bp的擴(kuò)增產(chǎn)物,分析可能含有2個(gè)拷貝數(shù)的整合子,一個(gè)含有aadA5和dfr17耐藥基因盒,另一個(gè)含有aadA2耐藥基因盒,同時(shí)編碼介導(dǎo)對氨基糖苷類抗生素壯觀霉素、鏈霉素和磺胺類藥物甲氧氨芐嘧啶耐藥的基因。以上2種結(jié)構(gòu)的3′CS都含有sulI,是對磺胺類藥物的耐藥基因,這與藥敏檢測結(jié)果一致,對磺胺類抗生素復(fù)方新諾明有較高的耐藥性,達(dá)到25%。藥敏檢測結(jié)果中有18.75%對β-內(nèi)酰胺類耐藥,但是在耐藥基因盒中并未檢測出對β-內(nèi)酰胺類耐藥的基因,可能是因?yàn)楸敬螌?shí)驗(yàn)只檢測了第Ⅰ類整合子及其攜帶的基因盒,并未對其他類型的整合子進(jìn)行檢測,分析其耐藥基因。

整合子耐藥系統(tǒng)對于監(jiān)測細(xì)菌耐藥性的傳播具有重要意義[17]。整合子可以作為轉(zhuǎn)座子的組成部分參與耐藥基因的轉(zhuǎn)移,也可存在于染色體上,隨DNA的復(fù)制進(jìn)入到子代中。多數(shù)整合子并不只是捕獲1個(gè)耐藥基因盒,它可以同時(shí)捕獲多個(gè)耐藥基因盒,介導(dǎo)對多種抗生素的耐藥性。多重耐藥菌株的出現(xiàn),加大了臨床治療細(xì)菌感染的難度,而在食品中由于多重耐藥菌株的存在,導(dǎo)致了新的食品安全問題。本文從食源性細(xì)菌中檢測出了整合子及耐藥基因盒的存在,提示要從基因角度研究食品安全問題,為食源性致病菌安全控制技術(shù)的實(shí)施提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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Detection of classⅠintegron from foodbornesalmonellaand analysis on the drug resistance gene cassettes

ZHOURong,LILin,SUJian-yu*,LIBing,XUZhen-bo

(College of Light Industry and Food Sciences,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)

Objective:To investigate the drug resistance,the distribution of class Ⅰintegron and drug resistance gene cassette of foodbornesalmonella. Methods:K-B assay was applied to measure the drug resistance of foodbornesalmonellaisolated against fourteen antibiotics. The class Ⅰintegron and drug resistance gene cassette were detected by PCR sequencing of amplification products. Results:The highest drug resistance rate to β-lactams,aminoglycosides,quinonones and sulfa in foodbornesalmonellawas 18.75%,12.5%,6.25% and 25%. 59.4%(19/32)of foodbornesalmonellawere positive for classⅠintegron. The product by PCR amplifying of classⅠintegron was 1009bp and 1664bp. In the drug resistance cassettes of variable regions of classⅠintegrons there were 3 types drug resistance genes,includingaadA5,dfr17 andaadA2,which induced the resistance to aminoglycosides antibiotics spectinomycin,streptomycin and sulfonamides drugs trimethoprim. Conclusion:High multidrug resistance and class I integron carrying had been identified among the foodbornesalmonella. The result stressed the need for continued surveillance of foodborne antibiotic resistance bacteria in the molecular level.

Salmonella;class Ⅰintegron;resistance gene cassette;drug resistance

2013-05-29 *通訊聯(lián)系人

周蓉(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：病原微生物及功能抗菌劑制備。

教育部博士點(diǎn)基金新教師基金項(xiàng)目(20110172120033);國家自然科學(xué)基金(31101278和31201362)資助。

TS201.1

：A

：1002-0306(2014)01-0279-05