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(廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室,廣東省普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點實驗室,廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東湛江 524000)

響應(yīng)面法優(yōu)化BacillusamyloliquefaciensZJHD-06產(chǎn)類細(xì)菌素發(fā)酵培養(yǎng)基

安俊瑩,劉穎*,朱雯娟,胡雪瓊,葉莉珍

(廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室,廣東省普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點實驗室,廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東湛江 524000)

以分離自海洋寶石石斑魚腸道的一種解淀粉芽孢桿菌ZJHD-06所產(chǎn)類細(xì)菌素為研究對象,以單核增生李斯特菌為抗菌活性測試指示菌,以抑菌圈直徑大小為指標(biāo),采用響應(yīng)面法對菌株ZJHD-06產(chǎn)類細(xì)菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化。通過Plackett-Burman 實驗篩選出對類細(xì)菌素產(chǎn)量具有顯著影響的因素,再通過最陡爬坡實驗確定顯著因素的中心水平,最后進行Box-Behnken實驗設(shè)計,最終得到的最佳配比為葡萄糖濃度4.80%,蛋白胨濃度0.47%,酵母浸膏濃度0.44%,NaCl、K2HPO4和MgSO4·7H2O濃度分別為1.0%、0.01%、0.03%。在該培養(yǎng)基配比下,發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑增加了27.8%。

響應(yīng)面,類細(xì)菌素,發(fā)酵培養(yǎng)基

細(xì)菌素是某些細(xì)菌在代謝過程中,通過核糖體合成機制產(chǎn)生的一類具有抑菌活性的多肽、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物,但它通常具有較窄的抑菌譜,只能殺死或抑制與其親緣關(guān)系近的其他微生物[1-2],這一性質(zhì)使它的應(yīng)用受到了一定的限制。隨著對細(xì)菌素研究的不斷深入,研究者發(fā)現(xiàn)了一些不符合或是完全不符合細(xì)菌素定義的蛋白類拮抗物質(zhì),不僅能抑制革蘭氏陽性菌還能抑制革蘭氏陰性菌和真菌,并被稱之為類細(xì)菌素[3]。由于它們具有高效、無毒、無殘留,并且能有效地抑制食品腐敗菌與致病菌的生長,近年來,它們作為有潛力的、結(jié)構(gòu)新穎的天然食品防腐劑得到了廣泛的研究[4]。目前,雖然已經(jīng)有乳酸菌、鏈霉菌、銅綠假單胞菌、芽孢桿菌屬[5-8]等產(chǎn)生類細(xì)菌素的報道,但是受化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用機理不明確、產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高等因素的制約,真正實現(xiàn)工業(yè)應(yīng)用的類細(xì)菌素只有乳酸鏈球菌素(Nisin)[9]。提高產(chǎn)量成為工業(yè)應(yīng)用要解決的關(guān)鍵問題之一。微生物的生長和代謝產(chǎn)物的積累受培養(yǎng)基的組分如碳源、氮源、生長因子、無機鹽等多種因子的影響,因此優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基成分是一個提高類細(xì)菌素產(chǎn)量的有效辦法[10]。響應(yīng)面法(response surface methodology,RSM)是利用合理的實驗設(shè)計,建立多元二次方程模型來擬合因素和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系,通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝,解決多變量問題的一種統(tǒng)計學(xué)方法,該法被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、生物、食品、化工等領(lǐng)域[11]。本研究利用響應(yīng)面法對從海洋寶石石斑魚腸道中分離得到一株產(chǎn)類細(xì)菌素的解淀粉芽孢桿菌ZJHD-06(BacillusamyloliquefaciensZJHD-06)的發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化,以提高類細(xì)菌素的產(chǎn)量,為新型天然食品防腐劑的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

解淀粉芽孢桿菌ZJHD-06(BacillusamyloliquefaciensZJHD-06) 本實驗室分離得到；單核增生李斯特菌(ListeriamonocytogenesATCC 35152) 廣東省微生物研究所提供；營養(yǎng)肉湯(NB)、胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂(TSA)、胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯(TSB) 北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司。

YXQ-LS-50SI立式壓力蒸汽滅菌器、SPX-150B-Z恒溫培養(yǎng)箱、SW-CJ-2F超凈工作臺 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HZQ-R恒溫?fù)u床 東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；3-18K冷凍離心機 Sigma公司。

1.2實驗方法

1.2.1 菌種發(fā)酵及上清液的制備 采用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基將B.amyloliquefaciensZJHD-06連續(xù)活化2代,每代30℃、200r/min下培養(yǎng)12h?；罨缶喊?%接種量接種至每個實驗培養(yǎng)基(50mL/250mL錐形瓶),30℃、200r/min下培養(yǎng)72h。將各發(fā)酵液于12000r/min 4℃離心15min,收集上清液,并用0.22μm的濾膜過濾,濾液的pH調(diào)至7.0,4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 Plackett-Burman實驗設(shè)計 對影響發(fā)酵結(jié)果的培養(yǎng)基中的碳源(葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米粉),氮源(蛋白胨、酵母浸膏、黃豆粉、綠豆粉),無機鹽(NaCl、K2HPO4、MgSO4·7H2O)三大營養(yǎng)因子進行考察,采用Plackett-Burman法設(shè)計11因素2水平的實驗,以抑菌圈直徑為響應(yīng)值,篩選影響類細(xì)菌素產(chǎn)量的主效因素,實驗因素水平及編碼見表1。實驗設(shè)計中低水平(-1)與高水平(1)的濃度是在菌株篩選時發(fā)酵培養(yǎng)基成分的基礎(chǔ)上經(jīng)過預(yù)實驗所得。

表1 Plackett-Burman設(shè)計的因素水平及編碼

1.2.3 最陡爬坡實驗 以實驗結(jié)果即抑菌圈直徑變化的梯度方向為爬坡方向,根據(jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化步長,能快速、經(jīng)濟的逼近最佳區(qū)域。根據(jù)Plackett-Burman實驗得出的結(jié)果安排最陡爬坡實驗,實驗安排見表5。

1.2.4 Box-Behnken實驗設(shè)計 經(jīng)Plackett-Burman實驗確定的主效因素作為設(shè)計因素,最陡爬坡實驗確定的最優(yōu)水平作為中心水平,設(shè)計Box-Behnken實驗,實驗因素水平及編碼見表2。

表2 Box-Behnken實驗因素水平及編碼

1.2.5 類細(xì)菌素抗菌活性測定 指示菌懸液的制備：將L.monocytogenes按1%的接種量接種到用胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯37℃培養(yǎng)12h,之后用生理鹽水稀釋至OD600=0.6,4℃保存。

牛津杯雙層平板法[12]：先向滅菌平皿中加入約5mL素瓊脂,凝固后擺放已滅菌的牛津杯,再向平皿內(nèi)加入含有指示菌菌懸液的胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂,凝固后取出牛津杯,向孔內(nèi)加入100μL的發(fā)酵上清液,4℃下擴散2h后37℃培養(yǎng)24h,用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1影響類細(xì)菌素產(chǎn)量的主效因素的確定

本實驗采用N=12的Plackett-Burman實驗設(shè)計,用JMP7.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。Plackett-Burman實驗安排及結(jié)果見表3。

根據(jù)分析各因素對響應(yīng)值顯著性檢驗結(jié)果的p值來判斷各因子對實驗影響的程度,見表4。由表4可知,葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏三個因素為主效因子(p<0.05),它們對類細(xì)菌素產(chǎn)量影響顯著,尤其是葡萄糖(p<0.01)對類細(xì)菌素產(chǎn)量影響極顯著。因為無機鹽是微生物必不可少的生長因素,對于不顯著的無機鹽因素NaCl、K2HPO4、MgSO4·7H2O在之后實驗中的濃度保持低水平,分別是1.0%、0.01%、0.03%。

表3 Plackett-Burman實驗安排及結(jié)果

表4 各因素對響應(yīng)值的顯著性檢驗結(jié)果

注：**代表對實驗結(jié)果有極顯著影響(p<0.01),*代表對實驗結(jié)果有顯著影響(p<0.05),表8同。

2.2最陡爬坡路徑

由表4可知，葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏這三個因素對實驗結(jié)果影響都為正效應(yīng),所以在最陡爬坡實驗中它們的變化方向是逐漸增加的。根據(jù)這三個因素效應(yīng)大小的比例設(shè)定它們的變化方向以及步長,無機鹽因素分別取各自的低水平進行實驗。實驗設(shè)計及結(jié)果見表5,可以看出葡萄糖濃度3.0%、蛋白胨濃度0.3%、酵母浸膏濃度0.3%時實驗抑菌圈直徑最大,所以以3.0%、0.3%、0.3%為葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏的中心水平設(shè)計Box-Behnken實驗。

2.3 Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果分析

2.3.1 二次回歸模型擬合及方差分析 以Plackett-Burman實驗確定的葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏這三個主效因素為設(shè)計因素,以最陡爬坡實驗確定的最優(yōu)濃度為中心水平進行3因素3水平N=15的Box-Behnken設(shè)計,實驗設(shè)計及結(jié)果見表6。

表5 最陡爬坡實驗安排及結(jié)果

表6 Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)實驗結(jié)果,運用JMP7.0軟件進行二次回歸分析,其回歸方程為Y=21.833+1.225X1+1.186X2+1.038X3-1.379X12+1.050X1X2+0.550X1X3-1.404X22+0.375X2X3-1.354X32。

表7 回歸方程的方差分析表

對回歸方程的各個因素進行顯著性檢驗的結(jié)果見表8。可知,葡萄糖濃度、蛋白胨濃度、酵母膏濃度的一次項和二次項對類細(xì)菌素的產(chǎn)量影響極顯著,葡萄糖濃度和蛋白胨濃度的交互作用對類細(xì)菌素的產(chǎn)量都有顯著影響。

表8 回歸方程參數(shù)估計

2.3.2 響應(yīng)面分析和最佳培養(yǎng)基配比確定 葡萄糖與蛋白胨、葡萄糖與酵母浸膏、蛋白胨與酵母浸膏之間的交互作用如圖1～圖3所示。

圖1 葡萄糖與蛋白胨交互作用的響應(yīng)面圖

圖2 葡萄糖與酵母浸膏交互作用的響應(yīng)面圖

圖3 蛋白胨與酵母浸膏交互作用的響應(yīng)面圖

從圖1～圖3可以看出響應(yīng)面都為開口向下的凸型曲面,說明實驗存在抑菌圈直徑的最大值。比較三個圖可以看出圖1的響應(yīng)面陡峭程度最高,這說明了葡萄糖濃度和蛋白胨濃度對抑菌圈直徑的交互作用最明顯。這也許因為葡萄糖和蛋白胨是培養(yǎng)基中的主要碳源和氮源,碳源和氮源是細(xì)菌生長必不可少的因素。葡萄糖和蛋白胨的添加比例也對類細(xì)菌素的產(chǎn)量有著顯著的影響[13]。

對簡化的二次回歸方程Y=21.833+1.225X1+1.186X2+1.038X3-1.379X12+1.050X1X2-1.404X22-1.354X32進行求解得出極值點為X1=0.905、X2=0.853、X3=0.685,通過計算得出對應(yīng)的葡萄糖濃度為4.810%,蛋白胨濃度為0.471%,酵母浸膏濃度為0.437%,預(yù)測的抑菌圈最大直徑為23.25mm?？紤]到實際發(fā)酵生產(chǎn),得出發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配比為葡萄糖4.80%,蛋白胨0.47%,酵母浸膏0.44%,NaCl、K2HPO4和MgSO4·7H2O保持低水平濃度分別為1.0%、0.01%、0.03%。

2.3.3 驗證實驗 為了驗證預(yù)測值的真實性,按照考慮實際生產(chǎn)所得的最佳配比做了3次重復(fù)實驗,實驗所得的平均值為22.98mm,只比預(yù)測的抑菌圈最大直徑少0.27mm,這說明預(yù)測值與真實值之間有良好的擬合度。

從驗證實驗結(jié)果可以看出,培養(yǎng)基優(yōu)化后發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑有了明顯的增加,這與一些文獻的實驗結(jié)果一致。如曹小紅等[14]利用響應(yīng)面法優(yōu)化BacillusnattoTK-1產(chǎn)脂肽發(fā)酵培養(yǎng)基使脂肽產(chǎn)量提高了約30%。劉國榮等[15]利用響應(yīng)面法優(yōu)化彎曲乳桿菌RX-6代謝產(chǎn)細(xì)菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基組成時得到的最佳配方使得細(xì)菌素效價增加了2.46倍。

3 結(jié)論

本文采用響應(yīng)面法對B.amyloliquefaciensZJHD-06產(chǎn)類細(xì)菌素發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化,首先利用Plackett-Burman實驗篩選出葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏這三個因素為主效因素,經(jīng)過最陡爬坡實驗確定3%、0.3%、0.3%為中心水平后,進行Box-Behnken實驗設(shè)計,對實驗結(jié)果進行分析,得出產(chǎn)類細(xì)菌素的培養(yǎng)基的最佳配比為葡萄糖4.80%,蛋白胨0.47%,酵母浸膏0.44%,NaCl、K2HPO4和MgSO4·7H2O保持低水平濃度分別為1.0%、0.01%、0.03%。運用該配比進行驗證實驗,抑菌圈的直徑高達22.98mm,比較之前的實驗結(jié)果抑菌圈直徑(平均直徑18.0mm)增加了27.8%。

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Optimization of fermentation medium ofBacillusamyloliquefaciensZJHD-06 by response surface methodology

ANJun-ying,LIUYing*,ZHUWen-juan,HUXue-qiong,YELi-zhen

(Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety,Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution,College of Food Science and Technology,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524000,China)

The fermentation medium ofBacillusamyloliquefacienZJHD-06 isolated from intestine ofEpinephelusareolatuswas optimized for a bacteriocin-like substance(BLS)production. Bacteriostatic circle diameter was used as evaluation index againstL.monocytogenesATCC 35152. Firstly,the notable factors were screened by Plackett-Burman experiment design. Then,the path of steepest ascent was undertaken to approach the optimal region of the significant factors. Finally,Box-Behnken design was adopted to identify optimal proportion. The results showed the optimal proportions were glucose 4.80%,peptone 0.47%,yeast extract 0.44%,NaCl 1.0%,K2HPO40.01% and MgSO4·7H2O 0.03%. The bacteriostatic circle diameter of the fermentation supernatant was increased by 27.8% using the optimal proportions.

response surface methology;bacteriocin-like substance;fermentation medium

2013-07-10 *通訊聯(lián)系人

安俊瑩(1988-)，女，碩士研究生，研究方向：海洋生物資源利用。

廣東省自然科學(xué)基金(S2011010000328)；廣東省科學(xué)技術(shù)廳(粵科規(guī)劃字[2009]198號)。

TS201.1

：B

：1002-0306(2014)01-0191-05