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(1.東北農業(yè)大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030； 2. 東北農業(yè)大學國家大豆工程技術研究中心,黑龍江哈爾濱 150030)

海藻酸鈉-殼聚糖固定化胃蛋白酶的研究

李曉靜1,侯俊財1,*,江連洲1,朱秀清2,韓宗元1,吳瑤1,張佳秀1,高夢妮1,韓巍巍1,曹秋閣1,耿浩1

(1.東北農業(yè)大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030； 2. 東北農業(yè)大學國家大豆工程技術研究中心,黑龍江哈爾濱 150030)

采用海藻酸鈉-殼聚糖包埋交聯(lián)法對胃蛋白酶進行固定化。以固定化酶的活力回收率為指標,探討了固定化的條件及固定化胃蛋白酶與游離胃蛋白酶的酶學性質。結果表明：最優(yōu)固定化條件為,海藻酸鈉濃度為3.40%,殼聚糖濃度為3.39%,CaCl2濃度為3.64%,游離酶稀釋倍數(shù)20倍,交聯(lián)時間4h,固定化酶回收率74.87%±1.07%；固定化酶的最適溫度47℃,最適pH3.5；得到的固定化酶的操作穩(wěn)定性和熱力學穩(wěn)定性都較好,該固定化酶重復使用5次后,活力仍可以保持62%以上。

海藻酸鈉,殼聚糖,胃蛋白酶,固定化酶

酶作為一種天然的高效催化劑,已得到了廣泛的應用,但游離酶具有不穩(wěn)定與易變性等缺點,使產品的生產成本居高不下,這極大限制了其在食品工業(yè)化生產中的應用[1]。固定化技術是20世紀中期發(fā)展起來的一項新型生物技術,起步于20世紀50年代,于1971年第1屆國際酶工程(EnzymoEngineerin)會議上正式采用了“固定化酶”的名稱[2]。近年來,固定化酶的載體和研究方法都有了很大的進展,在現(xiàn)代食品行業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、能源開發(fā)等環(huán)境領域都得到了廣泛的應用。固定化酶是用一定的材料將活性酶束縛或限制于一定的區(qū)域內,但仍能進行酶所特有的催化反應,并可回收及重復使用的一種新技術[1],制得的固定化酶具有很高的穩(wěn)定性,在反應過程中容易控制,可反復循環(huán)利用,延長了酶的使用期限,同時增強了酶的使用效率,并降低了生產成本。 制備固定化酶的方法有很多種,其中包埋法制備固定化酶是不需要化學修飾酶蛋白的氨基酸殘基,且具有反應條件溫和、酶活力損失小等優(yōu)點,是常用于制備固定化酶的方法。吳國杰等[2]探討了海藻酸鈉-殼聚糖固定化載體的制備及應用研究,對各因素的影響進行了探討,為海藻酸鈉-殼聚糖作為載體提供了理論依據(jù),并充分說明殼聚糖-海藻酸鈉作為固定化載體的可行性。高尚欣等[11]探討了海藻酸鈉-殼聚糖共固定化菠蘿莖蛋白酶的研究,對影響因素進行研究,詳細說明了各個條件的關鍵點。張佳寧等[7]探討了殼聚糖-海藻酸鈉固定化磷脂酶A2的研究,對制備過程中不同條件對結果的影響進行了研究,為以后固定化酶打下良好的基礎。鑒于海藻酸鈉和殼聚糖均是無毒、生物相容性好、可生物降解的天然高分子材料,且具有一定的保健功能[2]。所以常用海藻酸鈉、殼聚糖作為包埋材料,制備固定化酶[3-4]。胃蛋白酶是從豬、?；蜓虻奈刚衬ぶ刑崛〉?為白色粉末,無霉敗臭味,有引濕性,水溶液呈酸性的一種消化性動物蛋白酶[5],適宜在酸性條件水解蛋白肽類。常用于助消化類的藥物中,又因其水解后的產物利于消化吸收,抗氧化性較好,被廣泛應用在水解植物蛋白中,但因其穩(wěn)定性差,易受外界影響變性失活,且酶與底物混合反應后難以回收利用,增加了生產成本。且酶與反應產物混在一起,也給產物的后續(xù)分離純化帶來了不便,固定化酶相比于游離酶對熱、pH等條件的穩(wěn)定性有所提高,而且對酶抑制劑的敏感性降低,易于分離,改善了后處理過程[6]。本實驗主要以殼聚糖-海藻酸鈉為載體,固定化胃蛋白酶,以提高酶的利用率,并對海藻酸鈉濃度、殼聚糖濃度、CaCl2濃度和交聯(lián)時間等因素對固定化胃蛋白酶活力回收率的影響進行研究,最終優(yōu)化出酶的最佳固定化條件。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

海藻酸鈉(脫乙酰度 85%) 天津市遠航化學藥品有限公司經銷；殼聚糖 國藥集團化學試劑有限公司；戊二醛(50%) 天津市耀華化學試劑有限責任公司；胃蛋白酶(1∶3000) 中國惠世生化試劑有限公司上海；酪蛋白 北京奧博星生物技術有限責任公司；乳酸和冰乙酸 天津市富宇精細化工有限公司；碳酸鈉和乳酸鈉 天津市巴斯夫化工有限公司；三氯醋酸 江蘇市永華精細化學品有限公司；其他試劑均為分析純試劑或生化試劑(市售)。

LGJ-1 型冷凍干燥機 上海醫(yī)用分析儀器廠；恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；UV759CRT型紫外可見分光光度計 上海佑科儀器公司。

1.2實驗方法

1.2.1 固定化胃蛋白酶的制備方法 稱取一定量的海藻酸鈉加水50mL,在37℃水浴鍋中保溫溶解一段時間,向海藻酸鈉溶液中加入5mL用pH2.3的乳酸-乳酸鈉緩沖溶液稀釋一定倍數(shù)的酶液,使之攪拌均勻,靜置一段時間,同時稱取一定量的殼聚糖使之溶解在5%的HAc溶液中,并加入一定量的3% CaCl2溶液,在37℃水浴中充分混勻。用無菌的5號注射器將含有酶液的海藻酸鈉溶液以3滴/s的速度滴加到一定量的殼聚糖醋酸溶液與CaCl2混合溶液中,凝固2min,再加入一定濃度的戊二醛溶液,攪拌1.5h后,放在4℃冰箱中交聯(lián)一段時間。用蒸餾水洗滌,然后進行冷凍干燥,即可得到固定化胃蛋白酶。

1.2.2 單因素實驗 游離酶添加量稀釋10倍,海藻酸鈉濃度為2%,殼聚糖濃度為2%,CaCl2濃度為3%,固定化時間2h,控制4因素不變,變化1個因素,游離酶添加量稀釋倍數(shù)5～25倍,海藻酸鈉濃度1%～5%,殼聚糖濃度1%～5%,CaCl2濃度2%～6%,固定化時間1～5h,來確定各因素對固定化效果的影響。

1.2.3 響應面實驗設計 在單因素的基礎上,確定各因素的最佳水平值范圍,采用Design Expert 8.06軟件進行響應面中心組合實驗設計,研究各固定化影響因素對固定化酶活力回收率的影響規(guī)律,并得到固定化胃蛋白酶的最佳條件。

以游離酶添加量(A)、海藻酸鈉濃度(B)、殼聚糖濃度(C)、氯化鈣濃度(D)、交聯(lián)時間(E)為自變量,固定化酶酶活回收率(R1)為響應值設計響應面實驗。自變量水平編碼見表1。

表1 實驗因素水平編碼表

1.2.4 游離蛋白酶與固定胃蛋白酶活力的測定 胃蛋白酶酶活力采用福林-酚法測定蛋白酶活力,即國家標準SB/T13017-1999,固定化酶活力單位為U/g。

1.2.5 固定化酶活回收率的計算方法 固定化酶活性回收率(%)=(固定化酶活力/固定化前游離酶的活力)×100

1.2.6 固定化酶的性質研究

1.2.6.1 固定化酶和游離酶的熱穩(wěn)定比較 取一定量的固定化酶和游離酶,在不同的溫度下(17、27、37、47、57、67和77℃)測定游離酶與固定化酶的活力。

1.2.6.2 pH對固定化酶和游離酶酶活力的影響 取一定量的固定化酶和游離酶,分別在pH1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 和4.0條件下測定固定化酶和游離酶的活力。

2 結果與討論

2.1酪氨酸標準曲線的繪制

按1.2.2福林-酚法,由測得數(shù)據(jù)繪制酪氨酸標準曲線,標準方程為Y=0.0069X+0.0068,R2=0.9995。

圖1 酪氨酸標準曲線

2.2固定化胃蛋白酶條件對固定化蛋白酶活力的影響

2.2.1 游離酶的稀釋倍數(shù)對固定化酶活力的影響 由圖2 可以看出,在稀釋5～20倍之間,隨著游離酶稀釋倍數(shù)的增加,固定化酶回收率緩慢增加,可能是由于當稀釋倍數(shù)較低時,相對游離酶濃度較大,載體上蛋白結合點達到飽和,酶分子之間相互聚焦,造成了酶活性中心結構發(fā)生改變,所以導致固定化酶回收率相對較低,而隨著稀釋倍數(shù)的增加,固定化酶回收率直線下降,主要是由于此時開始載體上的蛋白質結合點未達到飽和,所以固定化酶回收率降低[8]。

圖2 游離酶的稀釋倍數(shù)對固定化胃蛋白酶活力的影響

2.2.2 海藻酸鈉濃度對固定化酶活力的影響 由圖3可以看出,當海藻酸鈉濃度為3%時,固定化酶回收率最高。在制備固定化酶時,明顯看到,海藻酸鈉濃度是直接影響固定化酶成球的主要因素。當海藻酸鈉濃度低于3%時,固定化酶微球表面形成的固定化膜強度不夠,導致球型不飽滿,微球的凝膠孔徑較大,酶液容易流失,所以酶活較低；隨著海藻酸鈉濃度增大,固定化酶微球型比較飽滿結實,但由于粘度的增大,制得的固定化酶容易出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象,微球的凝膠孔徑也隨之變小,影響了酶與底物的結合,因此最適的海藻酸鈉濃度為3%。

圖3 海藻酸鈉濃度對固定化胃蛋白酶活力的影響

2.2.3 殼聚糖濃度對固定化酶活力的影響 由圖4 可以看出,殼聚糖濃度為3%時,固定化酶回收率最高。當殼聚糖濃度大于3%時,固定化酶回收率開始下降,原因是過大的殼聚糖濃度,使得微膠囊表面的聚電解質膜,更加致密,造成底物擴散困難、固定化酶活力回收降低,而且殼聚糖濃度過高形成的膠囊不易洗滌分離[7]。所以殼聚糖的濃度應該選擇在3%。

圖4 殼聚糖濃度對固定化胃蛋白酶活力的影響

2.2.4 鈣離子濃度對固定化酶活力的影響 CaCl2與海藻酸鈉反應形成海藻酸鈣凝膠是固定化酶的重要過程,CaCl2質量分數(shù)對形成凝膠的機械強度有重要影響[8]。由圖5可以看出,低于3%時,隨著鈣離子濃度增大,酶活力回收率逐漸增大；當大于3%時,隨著鈣離子濃度的增大,固定化酶回收率逐漸下降。主要原因是當鈣離子濃度增大時,較多的鈣離子會附著在固定酶微球的凝膠表面,影響了固定化酶的活力。

圖5 鈣離子濃度對固定化胃蛋白酶活力的影響

2.2.5 交聯(lián)時間對固定化酶活力的影響 由圖6可知,交聯(lián)時間為4h時,固定化酶活力回收率較高,固化時間在1～4h范圍內,由于海藻酸鈉-殼聚糖包埋逐漸緊密,酶流失量減小,固定化酶活力回收率逐漸增加；但當時間超過4h后,回收率逐漸降低,原因在于固定化時間過長,海藻酸鈉鈣結構過于致密,底物的擴散阻力增加[9],酶活力降低,所以選用4h為最佳固定化時間。

圖6 交聯(lián)時間對固定化胃蛋白酶活力的影響

通過單因素實驗結果,采用Design Expert8.06響應面設計,以交聯(lián)時間(A)、海藻酸鈉濃度(B)、游離酶稀釋倍數(shù)(C)、氯化鈣濃度(D)、殼聚糖濃度(E)為自變量,固定化酶酶活回收率(R1)為響應面值設計響應面實驗。實驗設計方案與結果見表2。

利用 Design Expert 8.06軟件對實驗結果進行方差分析,結果見表3(p值<0.05 為顯著項)通過對實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,得到酶活回收率(R1)對交聯(lián)時間(A)、海藻酸鈉濃度(B)、游離酶稀釋倍數(shù)(C)、氯化鈣濃度(D)、殼聚糖濃度(E)的回歸方程為:

R1=74.46-0.48A-0.35B+0.55C-0.034D-0.32E+0.97AB-0.26AC+1.65AD+0.59AE+2.40BC-2.29BD-0.19BE+1.37CD+0.16CE+0.15DE-0.63A2-1.81B2-0.42C2-1.67D2-0.57E2

表2 響應面實驗方案及結果

表3 方差分析結果

應用Design Expert 8.06進行響應面優(yōu)化分析方法對回歸模型進行分析,得到最優(yōu)響應面結果為交聯(lián)時間4h,海藻酸鈉濃度為3.40%,游離酶稀釋倍數(shù)為20倍,鈣離子濃度為3.64%,殼聚糖濃度為3.39%,固定化酶活回收率為74.87%±1.07%。

各兩因素交互作用(顯著項)對固定化酶活回收率影響的響應面圖見圖7。

圖7 各兩因素交互作用影響(顯著項) 對固定化效果影響的響應面圖

固定C、D、E三因素到零水平,交聯(lián)時間(A)和海藻酸鈉濃度(B)有顯著交互作用,由圖7知,在不同海藻酸鈉濃度條件下,在一定范圍內,隨著交聯(lián)時間增大,固定化酶回收率減??；在不同交聯(lián)時間的條件下,在一定范圍內,隨著海藻酸鈉濃度的增加,固定化酶回收率先增加后減小。

氣象災害來臨之際，因氣象部門或地方政府錯誤估計了災害天氣的嚴重程度，或者沒有做好災害防御工作，災后救援工作不及時等，最后導致防災減災工作沒有達到預期效果，嚴重威脅到了社會公共安全和人民群眾的生命財產安全。

固定B、C、E三因素到零水平,交聯(lián)時間(A)和鈣離子濃度(D)有顯著交互作用,由圖7知,在不同鈣離子濃度條件下,在一定范圍內,隨著交聯(lián)時間增大,固定化酶回收率減??；在不同交聯(lián)時間的條件下,在一定范圍內,隨著鈣離子濃度的增加,固定化酶回收率減小。

固定B、C、D三因素到零水平,交聯(lián)時間(A)和殼聚糖濃度(E)有顯著交互作用,由圖7知,在不同殼聚糖濃度條件下,在一定范圍內,隨著交聯(lián)時間增大,固定化酶回收率先保持不變后減?。辉诓煌宦?lián)時間的條件下,在一定范圍內,隨著殼聚糖濃度的增加,固定化酶回收率先不變后減小。

固定A、D、E三因素到零水平,海藻酸鈉濃度(B)和游離酶稀釋倍數(shù)(C)有顯著交互作用,由圖7知,在不同游離酶稀釋倍數(shù)條件下,在一定范圍內,隨著海藻酸鈉濃度增大,固定化酶回收率先增大后減?。辉诓煌Ｔ逅徕c濃度的條件下,在一定范圍內,隨著游離酶稀釋倍數(shù)的增加,固定化酶回收率先增大減小。

固定A、C、E三因素到零水平,海藻酸鈉濃度(B)和鈣離子濃度(D)有顯著交互作用,由圖7知,在不同鈣離子濃度條件下,在一定范圍內,隨著海藻酸鈉增大,固定化酶回收率先增大后減??；在不同海藻酸鈉的條件下,在一定范圍內,隨著鈣離子濃度的增加,固定化酶回收率先增大后保持不變。

固定A、B、E三因素到零水平,游離酶稀釋倍數(shù)(C)和鈣離子濃度(D)有顯著交互作用,由圖7知,在不同鈣離子濃度條件下,在一定范圍內,隨著游離酶稀釋倍數(shù)的增大,固定化酶回收率逐漸減??；在不同游離酶稀釋倍數(shù)的條件下,在一定范圍內,隨著鈣離子濃度的增加,固定化酶回收率先保持不變后減小。

2.3驗證實驗

在響應面分析法求得的最佳條件下,即交聯(lián)時間4h,海藻酸鈉濃度為3.40%,游離酶稀釋倍數(shù)為20倍,鈣離子濃度為3.64%,殼聚糖濃度為3.39%,進行平行實驗(3次),3次平行實驗的平均值為75.02%。響應值的實驗值與回歸方程預測值吻合良好,說明該模型能夠較好地預測實際固定化效果。

2.4.1 固定化酶和游離酶的熱穩(wěn)定比較 結果如圖8所示,游離酶的最適溫度為37℃,固定化酶的最適溫度為47℃,可見固定化后酶的耐熱性有所提高。結果表明酶經固定化后最適溫度有所提高,可能由于固定化過程中酶的結構發(fā)生了變化,同時載體對酶也有一定保護作用[10]。

圖8 不同溫度時游離酶和固定化酶的相對酶活力

2.4.2 pH對固定化酶和游離酶酶活力的影響 由圖9可知,當pH為2.0時,游離酶達到最適pH,而固定化酶的最適pH為3.5,表明固定化后的胃蛋白酶的最適pH適應范圍更加寬泛。

圖9 不同pH時游離酶和固定化酶的相對酶活力

2.4.3 固定化胃蛋白酶的操作穩(wěn)定性 由于固定化酶可以重復使用,所以測定相同條件下,重復使用5次后固定化酶的相對酶活力,以第一次測得的酶活力為100%,結果如圖10。

圖10 固定化酶的操作穩(wěn)定性

由圖10結果可知,重復5次以后,酶活力降為原來的 62.3%,相對活力的下降可能是由于在不斷攪拌的作用下,海藻酸鈉-殼聚糖載體持水性發(fā)生變化,酶的作用點隨著水解酪蛋白的不斷進行而逐漸暴露,以及固定化酶凝膠結構的改變所造成的結果。

3 結論

研究表明,海藻酸鈉-殼聚糖作為載體固定化胃蛋白酶的方法,具有工藝簡單、條件溫和及操作簡便的特點,且固定化作用的效果很好。得到的最佳固定化條件為：游離酶稀釋倍數(shù)為20倍,海藻酸鈉濃度為3.40%,殼聚糖濃度為3.39%,鈣離子濃度3.64%,時間為4h,固定化酶回收率74.87%,此種方法固定的胃蛋白酶的最適溫度為47℃,比游離酶升高了10℃；最適pH 為3.5與游離酶相比pH向堿性偏移1.5,固定化酶活力回收率為 74.87%；經 5次循環(huán)重復使用后,固定化酶活力降為原來的62.31%,說明殼聚糖-海藻酸鈉作為載體固定的胃蛋白酶的穩(wěn)定性比較好。

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The study of pepsin immobilized with alginate and chitosa

LIXiao-jing1,HOUJun-cai1,*,JIANGLian-zhou1,ZHUXiu-qing2,HANZong-yuan1,WUYao1,ZHANGJia-xiu1,GAOMeng-ni1,HANWei-wei1,CAOQiu-ge1,GENGHao1

(1. College of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China; 2. National Research Soybean Engineering and Technology Center,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

The pepsin was immobilized with the alginate and chitosan to crosslink. The enzymatic properties of the immobilized and free pepsin were studied to get the optimal parameters. The results showed that the optimal immobilization conditions were:the concentration of sodium alginate 3.40%,concentration of chitosan sugar 3.39%,concentration of CaCl23.64%,dilution fold of the free enzyme 20-fold,crosslinking time 4h,respectively. The recovery of the immobilized enzyme could reach 74.87%±1.07% at the optimum temperature of the immobilized enzyme 47℃ and optimum pH3.5,which obtained the operational and thermodynamic stability of the immobilized enzyme stability well. In addition,the immobilized enzyme activity after repeated use five times could still be maintained more than 62%.

alginat;chitosan;pepsin;immobilized enzyme

2013-06-25 *通訊聯(lián)系人

李曉靜(1987-),女,在讀碩士研究生,研究方向：食品科學與工程。

“十二五”農村領域國家科技計劃課題項目(2012BAD34B04)資助。

TS201.1

：A

：1002-0306(2014)01-0168-06