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(1.石河子大學(xué)食品學(xué)院,新疆石河子 832000； 2.新疆冠農(nóng)果茸集團(tuán)股份有限公司技術(shù)中心，新疆庫爾勒市 841000)

桶裝脹罐番茄醬中腐敗菌分離純化及鑒定研究

楊紅紅1,陳國剛1,劉婭1,江英1，*，王陳強(qiáng)2

(1.石河子大學(xué)食品學(xué)院,新疆石河子 832000； 2.新疆冠農(nóng)果茸集團(tuán)股份有限公司技術(shù)中心，新疆庫爾勒市 841000)

從脹罐番茄醬中分離出12株菌,并對這12株菌進(jìn)行傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)、生理生化特性鑒定,得出在這12株菌株中有4株芽孢桿菌,3株酵母菌,3株鏈球菌,2株霉菌。經(jīng)過反證實驗得出導(dǎo)致番茄醬脹袋的主要微生物是芽孢桿菌,酵母菌和霉菌,并通過16S rDNA序列分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹對優(yōu)勢菌群芽孢桿菌鑒定為4個種,分別為:枯草芽孢桿菌,短小芽孢桿菌,凝結(jié)芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌。確定了導(dǎo)致桶裝番茄醬脹袋的腐敗菌。

番茄醬,腐敗,分離,16S rDNA序列分析

番茄醬是鮮番茄的醬狀濃縮制品。具有番茄的特有風(fēng)味,是一種富有特色的調(diào)味品,一般不直接入口。常用作魚、肉等食物的烹飪佐料,是增色、添酸、助鮮、郁香的調(diào)味佳品。番茄產(chǎn)業(yè)是新疆農(nóng)產(chǎn)品加工中的支柱產(chǎn)業(yè),然而近年來由于番茄醬滯銷,大包裝產(chǎn)品基本在露天儲存,經(jīng)過不同季節(jié)及不同溫度的影響以及野蠻裝卸等因素,造成產(chǎn)品質(zhì)量變質(zhì)、脹桶漏醬、癟桶、銹蝕等現(xiàn)象,其中微生物引起的腐敗變質(zhì)便是其中重要的問題之一,產(chǎn)生產(chǎn)品脹袋和平酸腐敗,嚴(yán)重影響了我國番茄醬的出口效益[1-2]。P.villari等研究了貯藏過程中,桶裝濃縮番茄醬中微生物的群落(包括酵母菌、乳酸桿菌和霉菌)的變化情況,及對番茄醬品質(zhì)的影響[3]；B.J.O.Efiuvwewwere等分析了尼日利亞市場上銷售的三種番茄醬中的微生物構(gòu)成,分離出了四種主要的微生物菌群(即桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、乳酸桿菌和明串珠菌屬)[4]。國內(nèi)現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)中僅限于罐頭食品的商業(yè)無菌、霉菌的鏡檢計數(shù)及主要腐敗微生物的檢測(芽孢桿菌和葡萄球菌)。其中新疆進(jìn)出口檢驗檢疫局對番茄醬中細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群、厭氧菌和平酸菌、乳酸菌、酵母菌和霉菌的檢測方法進(jìn)行了探索和研究,建立了一套檢測番茄醬中幾種主要微生物的科學(xué)方法[5]。本文針對近年來困擾新疆番茄醬出口企業(yè)的大桶番茄醬腐敗脹罐現(xiàn)象,通過微生物分離、純化及分子生物學(xué)技術(shù),從腐敗變質(zhì)角度探究導(dǎo)致大桶番茄醬脹罐的微生物本質(zhì)。本文對已經(jīng)腐敗變質(zhì)的番茄醬進(jìn)行了微生物分離與鑒定,并通過16S rDNA 序列分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹將腐敗番茄醬中的優(yōu)勢菌群芽孢桿菌鑒定為種,以期為大桶番茄醬的防腐保藏措施的實施提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

番茄醬 由新疆胡陽河番茄制品有限公司提供,包括正常的桶裝番茄醬、已脹袋番茄醬、疑似脹袋番茄醬Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。番茄醬加工過程中的含鹽量為2.5%～3%,酸度0.5%～1.2%(以醋酸計),經(jīng)過阿氏殺菌(110～115℃)、冷卻到(35～37℃)后進(jìn)行灌裝,包裝形式為無菌袋裝桶,貯藏條件在38℃以下,脹袋和疑似脹袋的番茄醬是在55℃保溫5～7d后產(chǎn)生了脹袋現(xiàn)象。Ⅰ和Ⅱ色澤醬紅,氣味和滋味正常；Ⅲ色澤醬黑粘稠,有酸腐味,開袋時有氣體排出,Ⅳ色澤醬紅偏黑,滋味有酸味,開袋時發(fā)現(xiàn)有少量的氣體排出,將Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ三種醬置于55℃恒溫箱保溫10d,置于4℃冰箱備用,其代號分別為ⅡA、ⅢA、ⅣA,保溫后醬體顏色均變深,呈褐紅黑色,氣滋味同保溫前；正向引物27f(對應(yīng)于Escherichiacoil8-27位堿基)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、反向引物1495r(對應(yīng)于Escherichiacoil1495-1515位堿基)：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′[6]上海桑尼生物科技有限公司；蛋白胨、酵母膏、瓊脂等國產(chǎn)生化試劑；分離純化培養(yǎng)基 NA培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基、改良BCP培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基；生化培養(yǎng)基 淀粉培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基[7]。

AUY1200分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；DKZ-1型電熱恒溫振蕩水槽 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；KDC-1042低速離心機(jī) 科大創(chuàng)新有限公司；XMTB數(shù)顯溫控儀 余姚市東方電工儀器廠；ZHJH-C1115C智能型安全超凈工作臺 上海智誠分析儀器制造有限公司；OLYMPUS CHC生物顯微鏡 日本Olympus 公司；TD5A-WS臺式低速離心機(jī) 長沙湘儀離心儀器有限公司；JY04S凝膠成像儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；050-810PCR擴(kuò)增儀 Tgradient 48 Biometra Tgradient。

1.2實驗方法

1.2.1 密封性檢驗 將被檢密封袋先浸入溫水中預(yù)熱,再置于86℃水浴中,讓密封袋沉入水面以下5cm,然后觀察5min,若發(fā)現(xiàn)有小氣泡連續(xù)上升者,表明漏氣[8]。

1.2.2 內(nèi)容物增菌 樣袋洗凈、揉捏混勻、超凈工作臺紫外燈下照射30min,在無菌環(huán)境下用75%的酒精擦拭開口及周圍10cm范圍。然后用無菌小針扎幾個小孔(同時用倒置的無菌試管采集袋內(nèi)氣體,在酒精燈火焰旁試燃,檢驗氣體是否是氫氣),讓袋內(nèi)氣體緩慢排除,避免噴涌現(xiàn)象。然后用滅過菌的剪刀開口,分別取變質(zhì)和正常的番茄醬內(nèi)容物各25g,于225mL的生理鹽水中振蕩均勻后,再用吸管各吸取1mL菌懸液轉(zhuǎn)入10mL液體培養(yǎng)液中,于28、37、55℃三種溫度下連續(xù)培養(yǎng)4d,每隔24h記錄一次。

1.2.3 分離純化

1.2.3.1 芽孢桿菌的分離及純化 將樣品搖勻,各取1mL樣品放入滅過菌的1.5mL的EP管中,90℃沸水浴10min,然后吸取200μL以無菌涂菌棒分別涂布于營養(yǎng)肉湯瓊脂平板上,于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72h至長出單個菌落。再根據(jù)芽孢桿菌菌落形態(tài)特征,選取菌落形態(tài)明顯不同的幾種菌落,用無菌接種環(huán)分別于NA培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng),直到長出單個菌落。再分別挑取單個菌落然后劃線到LB斜面上,活化3代后,置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 其他菌的分離純化 將樣品搖勻,然后吸取200μL以無菌涂菌棒分別涂布于改良BCP培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基進(jìn)行28、37、55℃三種溫度條件進(jìn)行分離培養(yǎng),連續(xù)培養(yǎng)4d,每24h觀察記錄一次[6],將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別挑取少許細(xì)胞劃線到對應(yīng)的培養(yǎng)基上,分別置28、37、55℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),大菌苔長出后,檢查其特征是否一致,同時將細(xì)胞涂片染色后用顯微鏡檢查是否為單一的微生物。若發(fā)現(xiàn)有雜菌,需要再一次進(jìn)行分離純化,直到獲得純培養(yǎng),接種到相應(yīng)斜面培養(yǎng)基,于相應(yīng)最適溫度培養(yǎng),置于4℃冰箱保存?zhèn)溆帽４妗?/p>

1.2.4 鑒定方法 本實驗通過參考常見細(xì)菌鑒定手冊、伯杰細(xì)菌鑒定手冊[9-10]等微生物鑒定書籍采取菌落觀察、革蘭氏染色、芽孢染色并根據(jù)各菌株生理生化特性、生長特征等進(jìn)行菌株的鑒定。

1.2.5 反證實驗 將分離出的菌株反接種到正常的番茄醬中,每一菌株同時接種兩批,進(jìn)行平行實驗,每批12個樣袋,接種后進(jìn)行密封,每隔3d進(jìn)行采樣共培養(yǎng)15d,觀察是否有脹袋、異味和變色現(xiàn)象[11],取變質(zhì)的番茄醬進(jìn)行微生物的檢測并和正常番茄醬中分離出的微生物進(jìn)行比較,確定導(dǎo)致番茄醬的主要致腐菌。

1.2.6 分子生物學(xué)鑒定 將純化好的菌株接種于5mL無菌MRS液體培養(yǎng)基中,置37℃培養(yǎng)18～24h,基因組DNA提取參考文獻(xiàn)[12]方法。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min;94℃變性1min,58℃退火1min,72℃延伸2min,30個循環(huán);72℃末端延伸10min 4℃保存。反應(yīng)體系為50μL：10×E×Taq buffer 5μL,MgCl2(25mmol/L)4μL,dNTP MIX(2.5mmol/L each)4μL,引物27f(10pmol/mL)2μL,引物1495r(10pmol/μL)2μL,基因組DNA模板(100ng/μL)2μL,TaKaRa ExTaq酶(5U/μL)0.6μL,用ddH2O定容至50μL,擴(kuò)增反應(yīng)完畢后,取2μL的PCR產(chǎn)物與2μL 6×Loading buffer混合,加樣于1%瓊脂糖凝膠點樣孔中進(jìn)行電泳,如果PCR成功,則在約為1500bp處可見到清晰的條帶,純化后送上海桑尼生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。

得到的序列運用軟件拼接校準(zhǔn)排齊后在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)同源性比對,并利用軟件中的cluster W構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,以同源性大于99%為種的分界閾值將待測菌株鑒定到種[13],確定優(yōu)勢腐敗菌。

2 結(jié)果與討論

2.1增菌前檢測及增菌結(jié)果與分析

袋裝番茄醬密封性檢測結(jié)果表明實驗所用密封袋密封性良好,放入水中并未產(chǎn)生氣泡,無菌試管采集袋內(nèi)氣體,在酒精燈火焰旁試燃,沒有火焰產(chǎn)生,證明不是氫氣。

表2 桶裝番茄醬中腐敗微生物的菌落個體形態(tài)觀察

表3 桶裝番茄醬腐敗菌生理生化實驗結(jié)果

內(nèi)容物出現(xiàn)褐變、渾濁、粘稠的現(xiàn)象,導(dǎo)致番茄醬出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有化學(xué)因素和物理因素,比如番茄醬本身就有某些氧化酶使得番茄醬的顏色呈褐色而不是鮮艷的番茄本身顏色;番茄醬在貯藏過程中不同溫度和人為的野蠻裝卸對番茄醬品質(zhì)都有一定影響,而微生物是導(dǎo)致大桶番茄醬發(fā)生質(zhì)變的主要原因[14]。

2.2桶裝番茄醬腐敗微生物的分離

本實驗經(jīng)分離純化得到51株菌株,在NA培養(yǎng)基、改良BCP培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基中生長情況見表1。

表1 桶裝番茄醬腐敗微生物在不同培養(yǎng)基上的分離純化

由表1可知,從正常、疑似脹袋和脹袋番茄醬中總共分離出了51株菌,其中包括不產(chǎn)芽孢菌、芽孢桿菌、霉菌和酵母菌,將菌落形態(tài)一樣的,并且在同一種培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌株篩選出來,進(jìn)行革蘭氏和芽孢染色發(fā)現(xiàn)有同種菌株,其中芽孢桿菌為31株,不產(chǎn)芽孢菌為6株,霉菌、酵母菌為14株,可以看出在番茄醬中芽孢桿菌為優(yōu)勢菌群。經(jīng)過重復(fù)篩選后,選出12株不同的菌株進(jìn)行微生物形態(tài)學(xué)和生理生化的鑒定。

2.3桶裝番茄醬腐敗微生物的鑒定

2.3.1 桶裝番茄醬腐敗微生物的形態(tài)學(xué)鑒定 從表2可以看出,9和10菌落大而厚,菌落表面光滑、濕潤、粘稠,容易挑起,菌落質(zhì)地均勻,正反面和邊緣、中央部位的顏色都很均一,是同類菌,11和12參照霉菌鑒定手冊中霉菌的形態(tài)描述及檢索表,分別確定為：葡萄狀穗霉屬和灰綠曲霉。

2.3.2 生理生化實驗 為了進(jìn)一步確定純化菌株的具體種類,進(jìn)行了一部分生理生化實驗,實驗結(jié)果見表3。

由表3和表4可得出,1、2、3、4為芽孢桿菌屬,5、6、7、8為大腸埃希氏菌和棒桿菌屬；根據(jù)形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定得出9、10菌株為季也蒙假絲酵母和季氏畢赤氏酵母。

2.3.3 反證實驗結(jié)果 將分離出的12株菌反接種到正常的番茄醬中,每3d采樣觀察,取樣之前觀察番茄醬是否有脹袋現(xiàn)象,取出樣品后觀察是否有異味和變色現(xiàn)象,如果發(fā)生變質(zhì)就取0.1g番茄醬進(jìn)行微生物的檢測,并與正常番茄醬中分離出的微生物進(jìn)行比較,確定導(dǎo)致番茄醬脹袋的微生物,反證實驗結(jié)果見表4。

由表4可見,將12種菌株接種到番茄醬中,其品質(zhì)有一定改變,接種后的第7d,番茄醬品質(zhì)有明顯的變化,出現(xiàn)了不同程度的脹袋、變色和異味,第15d番茄醬的脹袋、變色和異味現(xiàn)象趨于穩(wěn)定,將接種后發(fā)生變質(zhì)的番茄醬取0.1g進(jìn)行微生物檢測后,同正常番茄醬中分離出的微生物進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),接種對應(yīng)菌株的數(shù)量大于正常番茄醬中該菌株的數(shù)量,由表4也可以看出1、2、3、4號主要的污染菌是芽孢桿菌,接種后異味、變色的現(xiàn)象都有發(fā)生,9和10號主要的產(chǎn)氣菌是酵母菌,而且產(chǎn)氣最明顯的是在3～7d中。由表4還可以看出,11、12號菌株接種到番茄醬中會引起番茄醬變色,可知霉菌會引起番茄醬色澤的變化,將脹袋中分離出的微生物與正常番茄醬中微生物進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)腐敗番茄醬中分離出的芽孢桿菌在菌群中所占比例最大,是腐敗番茄醬中的優(yōu)勢菌群。

表4 桶裝番茄醬腐敗微生物反證實驗結(jié)果

注:+生長；++生長良好;0 不生長。

2.3.3 分子生物學(xué)鑒定 主要致腐菌的16rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建見圖1。

圖1 分離自脹袋番茄醬中芽孢桿菌的 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

由圖1可以看出：Y1和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)位于同一分支,且這株菌的16S rDNA序列與Bacillussubtilis同源性均達(dá)到了99%,所以這株菌歸為Bacillussubtilis；Y2和短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)在一個分支上,結(jié)合16S rDNA序列同源性結(jié)果鑒定Y2為Bacilluspumilus；Y4的16S rDNA的序列與蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)AB680147的同源性達(dá)到99%,系統(tǒng)發(fā)育樹顯示它們與BacilluscereusAB680147在同一分支上,所以將Y4鑒定為Bacilluscereus；Y3和凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)處在同一分支,而其16S rDNA序列同源性結(jié)果達(dá)到了99%,故將其鑒定為Bacilluscoagulans,由系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出短小芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的親緣關(guān)系較近,和凝結(jié)芽孢桿菌菌種之間親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。

3 討論

傳統(tǒng)的微生物鑒定方法雖然經(jīng)過了很長時間的發(fā)展,已經(jīng)比較完善,但是由于鑒定步驟繁多,很多反應(yīng)是生物體的自然生理過程,耗時長,整個鑒定過程很緩慢;而且,很多性狀都是基于感官來判斷的,主觀的干擾很容易被引入,不能正確地反映微生態(tài),分類不夠準(zhǔn)確和科學(xué)。而以16S rDNA為基礎(chǔ)的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)克服了傳統(tǒng)鑒定和分類方法的局限性,而且提高了解析的靈敏度,在基因水平上擴(kuò)大了物種多樣性的視野,可以快速、微量、準(zhǔn)確簡便的對微生物進(jìn)行分類鑒定[15]。

以上鑒定結(jié)果可以看出,芽孢桿菌屬是腐敗番茄醬中的優(yōu)勢菌群,在反證實驗當(dāng)中芽孢桿菌是引起變質(zhì)的主要菌群,本實驗對脹袋番茄醬中致腐微生物進(jìn)行了傳統(tǒng)微生物鑒定和16S rDNA分子序列測序進(jìn)一步確定了腐敗番茄醬中的優(yōu)勢菌并將芽孢桿菌鑒定到種,構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹,明確了芽孢桿菌種之間的親緣關(guān)系,為大桶番茄醬的防腐措施提供了一定的理論指導(dǎo)。

4 結(jié)論

4.1 本實驗通過對番茄醬中腐敗微生物的分離純化得到12株菌,通過形態(tài)學(xué)鑒定和生理生化實驗確定從番茄醬中分離出的12株菌株有4株是芽孢桿菌,2株為大腸埃希氏菌和2株為棒桿菌屬,3株酵母菌,2株霉菌,其中芽孢桿菌是短小芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌,酵母菌是季氏畢赤氏酵母、季也蒙假絲酵母,霉菌是葡萄狀穗霉屬、灰綠曲霉。

4.2 通過反證實驗確定導(dǎo)致番茄醬脹袋的腐敗菌,結(jié)合傳統(tǒng)微生物鑒定和16S rDNA序列測定,確定腐敗番茄醬中的優(yōu)勢菌群為芽孢桿菌。并進(jìn)行了芽孢桿菌的系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建,將4株芽孢桿菌鑒定到種,通過對系統(tǒng)發(fā)育樹的觀察確定了短小芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的親緣關(guān)系較近,和凝結(jié)芽孢桿菌菌種之間親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。

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Study on isolation and identification of the spoilage microbes in bottled tomato sauce and their characteristics

YANGHong-hong1,CHENGuo-gang1,LIUYa1,JIANGYing1,*,WANGChen-qiang2

(1.College of Food,Shihezi University,Shihezi 832000,China; 2.Xinjiang Guannong Fruit & Antler Group Co.,Ltd,korla 841000,China)

A total of 12 strains were separated from metamorphic tomato sauce. It was obtained that there were fourBacillus,three Yeast,threeStreptococcus,two Molds,in these 12 strains by the traditional morphological,physiological and biochemical characteristics. The disprove experimentally indicated that the main microorganism that leaded to bulging bag of tomato sauce wereBacillus,Yeast and Mildew,furthermore through 16S rDNA sequence analysis and phylogenetic tree was constructed on the dominant bacteriaBacillusidentified four kinds,namely:Bacillussubtilis,Bacillupumilus,BacilluscereusandBacilluscoagulanc.Results suggested Spoilage caused the bulging bag of tomato sauce.

tomato sauce;taint;isolated;16S rDNA sequencing analysis

2013-07-01 *通訊聯(lián)系人

楊紅紅(1989-)，女，碩士研究生，研究方向:果蔬加工與貯藏。

自然基金項目(31260388);兵團(tuán)科技攻關(guān)計劃(2012BA013)。

TS201.3

：B

：1002-0306(2014)01-0164-05