宋艷麗，薛 瑞，吳 倩，張玉潔

鴉膽子是苦木科植物鴉膽子的成熟果實(shí)，出自于《本草綱目拾遺》，性味苦，寒，有毒，其能燥濕、解毒、殺蟲(chóng)，治療痢疾，抗瘧，扁平疣等[1]。鴉膽子油注射液是以鴉膽子仁石油醚提取物和精制大豆磷脂為原料制成的水包油型乳劑，研究發(fā)現(xiàn)其既有抗腫瘤作用還有免疫保護(hù)作用，聯(lián)合放化療治療對(duì)機(jī)體免疫功能有促進(jìn)作用，并可降低放化療所伴隨的毒性作用，提高患者的生活質(zhì)量和對(duì)治療的依從性[2～4]。有體外實(shí)驗(yàn)研究提示，鴉膽子油注射液可抑制膀胱癌、肺癌、食管癌和宮頸癌等細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5，6]，但對(duì)其作用機(jī)制方面的研究較少。本研究擬觀察鴉膽子油注射液在體內(nèi)外對(duì)H22肝癌細(xì)胞的抑制作用及其作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、動(dòng)物與試劑 肝癌H22細(xì)胞由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院提供；ICR小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄兼用，由襄陽(yáng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料公司）；RPMI 1640培養(yǎng)粉（Gibco公司）；順鉑（江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司）；MTT和胰蛋白酶（Sigma公司）；ELx800型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（BIO-TEK公司）；CO2孵箱（JOUAN公司）；定量檢測(cè)腫瘤壞死因子-α的酶聯(lián)免疫試劑盒（上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司）；檢測(cè)125I-轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α的放射免疫分析藥盒（北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 H22細(xì)胞增殖檢測(cè) 采用MTT法，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H22細(xì)胞，常規(guī)消化、洗滌后，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/ml，接種于96孔培養(yǎng)板中，于 5%CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的鴉膽子油注射液或順鉑各100μl，對(duì)照孔加入等容積的1640培養(yǎng)液，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后按常規(guī)采用酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)570 nm）測(cè)定各孔吸光度值(A)。按公式“（1-藥物孔A值/對(duì)照孔A值）×100%”計(jì)算細(xì)胞抑制率。

1.3 荷H22移植瘤小鼠模型的建立 按文獻(xiàn)[7]方法，用滅菌NS調(diào)整瘤細(xì)胞數(shù)至1×107/ml，計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)為98%以上可用。取ICR小鼠，除正常對(duì)照組外，其他組小鼠皆接種瘤細(xì)胞懸液0.2 ml于右腋窩皮下。在24 h后，隨機(jī)分為荷瘤陰性對(duì)照組、5-Fu處理組和鴉膽子油處理組，每組10只。在正常對(duì)照組，給予生理鹽水0.2 ml灌胃，1次/d；給予荷瘤小鼠5-Fu 25 mg·kg-1·d-1或鴉膽子油 12.5 mg·kg-1·d-1、25 mg·kg-1·d-1和 50 mg·kg-1·d-1腹腔注射，皆連續(xù)給藥 10 d。于停藥后次日，自小鼠眼球采血后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，分別取腫瘤、脾臟和胸腺，稱(chēng)重。按以下公式計(jì)算抑瘤率和臟器指數(shù)：抑瘤率=（荷瘤組瘤質(zhì)量-給藥組瘤質(zhì)量）/荷瘤組瘤質(zhì)量×100%；脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）；胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。

1.4 脾細(xì)胞增殖檢測(cè)[8]停藥后次日頸椎脫臼處死小鼠，無(wú)菌操作條件下取出脾臟，剪碎，Hanks液洗滌，經(jīng)200目銅網(wǎng)過(guò)濾，離心，去上清，加入2 ml雙蒸水，滴管吹打30 s，立即加入1.8%氯化鈉溶液2 ml，離心，去上清，再加入Hanks液洗滌，直至溶液無(wú)紅色，即為各組脾細(xì)胞懸液。用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×107/ml，向脾細(xì)胞中加入Con A（或LPS），使ConA（或LPS）的終濃度為5μg/ml（或10μg/ml）。取上述細(xì)胞懸液200μl，加入96孔培養(yǎng)板，設(shè)只加ConA（或LPS）的對(duì)照孔。將培養(yǎng)板置于5%CO2、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。在結(jié)束培養(yǎng)前4 h加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入酸化異丙醇終止反應(yīng)，振蕩10 min使充分溶解，用酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)定各孔的OD值。

1.5 動(dòng)物血清細(xì)胞因子的測(cè)定 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)采用ABC-ELISA法測(cè)定TNF-α；采用放射免疫法測(cè)定TGF-α。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用Office 2007和SPSS15.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，多樣本比較采用Dunnett檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)H22細(xì)胞增殖的抑制作用 鴉膽子油在10～160μg·ml-1濃度范圍內(nèi)對(duì)H22細(xì)胞的體外增殖具有抑制作用，并具有濃度依耐性（表1）。

表1 鴉膽子油對(duì)H22細(xì)胞增殖（±s，n=6）的抑制作用

表1 鴉膽子油對(duì)H22細(xì)胞增殖（±s，n=6）的抑制作用

與對(duì)照組比，①P<0.05

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2.2 對(duì)荷瘤小鼠瘤質(zhì)量的影響 在給予5-Fu（25 mg·kg-1）腹腔注射10 d后可明顯抑制荷瘤小鼠的瘤質(zhì)量，與模型組比具有非常顯著性差異（P<0.05）；在給予鴉膽子油 12.5 mg·kg-1、25 mg·kg-1和 50 mg·kg-1灌胃后，均可不同程度地減輕荷瘤小鼠的瘤質(zhì)量，與模型組比均具有非常顯著性差異（P<0.05，表2）。

表2 荷瘤小鼠瘤質(zhì)量（g，±s，n=10）的變化

表2 荷瘤小鼠瘤質(zhì)量（g，±s，n=10）的變化

與荷瘤動(dòng)物比，①P<0.05

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2.3 對(duì)荷瘤小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響 荷瘤動(dòng)物脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)增加，與正常對(duì)照組比，具有顯著性差異（P<0.05），而5-Fu和三個(gè)劑量鴉膽子油處理對(duì)脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響較?。ū?）。

表3 荷瘤小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)（±s，n=10）的變化

表3 荷瘤小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)（±s，n=10）的變化

與對(duì)照組比，①P<0.05

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2.4 對(duì)荷瘤小鼠脾細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組比，荷瘤動(dòng)物脾細(xì)胞增殖受到抑制（P<0.05）；與荷瘤動(dòng)物比，在5-Fu腹腔注射后脾細(xì)胞增殖水平仍然低下；與荷瘤動(dòng)物比，鴉膽子油體內(nèi)給藥可促進(jìn)脾細(xì)胞增殖（P<0.05，表4）。

表4 荷瘤小鼠脾細(xì)胞增殖（OD值，±s，n=6）的變化

表4 荷瘤小鼠脾細(xì)胞增殖（OD值，±s，n=6）的變化

與對(duì)照組比，①P<0.05；與荷瘤動(dòng)物比，②P<0.05

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2.5 對(duì)荷瘤小鼠血清TNF-α和TGF-α水平的影響 見(jiàn)表5。

表5 荷瘤小鼠血清TNF-α和TGF-α水平（±s，n=6）的變化

表5 荷瘤小鼠血清TNF-α和TGF-α水平（±s，n=6）的變化

與對(duì)照組比，①P<0.05；與荷瘤動(dòng)物比，②P<0.05

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3 討論

中成藥鴉膽子油注射液已廣泛應(yīng)用于臨床治療各種惡性腫瘤，其主要的活性成分為不飽和脂肪酸-油酸和亞油酸[9]。鴉膽子油中的油酸和亞油酸與腫瘤細(xì)胞膜具有特異的親和力，有很強(qiáng)的抗癌活性[10]。鴉膽子油乳主要成分油酸能抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶活性，從而抑制細(xì)胞DNA的合成，阻斷癌細(xì)胞的增殖[11]。鴉膽子油還可選擇性破壞癌細(xì)胞和線(xiàn)粒體等膜性系統(tǒng)，使癌細(xì)胞變性壞死，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)損害；其對(duì)腫瘤細(xì)胞具有靶向性，用藥后藥物濃度濃集，并與癌細(xì)胞具有特異性的緊密親和力[12]。本研究結(jié)合MTT實(shí)驗(yàn)以及建立荷瘤模型小鼠觀察鴉膽子油注射液對(duì)H22細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明鴉膽子油體內(nèi)外均可抑制肝癌H22細(xì)胞的增殖，與對(duì)照組相比皆具有顯著性差異，且具有濃度依賴(lài)性。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后與人體的免疫功能密切相關(guān)，免疫系統(tǒng)作為機(jī)體的第一道防線(xiàn)，在惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的識(shí)別和清除過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[13]。機(jī)體在發(fā)生腫瘤后，免疫系統(tǒng)可通過(guò)多種方式對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)生應(yīng)答,并清除腫瘤細(xì)胞[14，15]。在機(jī)體抗腫瘤防御中，T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫和B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫共同發(fā)揮著重要作用。脾細(xì)胞富含T、B淋巴細(xì)胞，在ConA等因素刺激下可增殖分化，參與免疫應(yīng)答。本研究觀察到，給予鴉膽子油注射液灌胃給藥10天后，可明顯促進(jìn)由Con A和LPS分別誘導(dǎo)的荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞增殖，顯示其具有免疫促進(jìn)作用，但是對(duì)脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響較小。

TNF-α屬腫瘤壞死因子家族，由單核-巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、T細(xì)胞分泌，能夠激活T淋巴細(xì)胞、刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體和細(xì)胞因子，直接殺傷腫瘤細(xì)胞而對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞無(wú)明顯毒害作用；也可通過(guò)抑制腫瘤血管生成等間接途徑殺傷腫瘤細(xì)胞；還可誘導(dǎo)許多不同來(lái)源腫瘤細(xì)胞的凋亡，可作為腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的標(biāo)記物及鑒定腫瘤預(yù)后的一項(xiàng)指標(biāo)[16，17]。TGF-α為表皮生長(zhǎng)因子家族成員之一，在多種腫瘤中過(guò)度表達(dá)。TGF-α可與表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）結(jié)合，級(jí)聯(lián)激活MAPK信號(hào)系統(tǒng)，促使DNA合成，從而促使細(xì)胞增殖和分化，使腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)不受機(jī)體的控制，使細(xì)胞增殖失控，從而發(fā)生癌變[18，19]。TGF-α表達(dá)減弱可以加速肝癌細(xì)胞凋亡，而其表達(dá)增強(qiáng)則會(huì)抑制肝癌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，荷瘤模型小鼠血清TNF-α水平明顯降低，TGF-α水平明顯升高，說(shuō)明小鼠荷瘤以后其免疫功能受到抑制，而在給予鴉膽子油注射液灌胃給藥后，荷瘤小鼠血清TNF-α水平顯著升高，而TGF-α水平明顯降低，提示鴉膽子油可通過(guò)促進(jìn)血清TNF-α表達(dá)或/和抑制TGF-α表達(dá)，從而增強(qiáng)荷瘤機(jī)體的免疫功能。

綜上所述，鴉膽子油體內(nèi)外均可抑制肝癌H22細(xì)胞的增殖，還可提高機(jī)體的免疫功能，其調(diào)節(jié)免疫功能的作用與促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞增殖、上調(diào)TGF-α水平以及下調(diào)TNF-α水平有關(guān)，可能還有其他作用機(jī)制，尚需進(jìn)一步研究。

[1]路廣秀，范潔宇，馬瑞蓮.鴉膽子臨床新用及研究進(jìn)展，內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，34（5）:423-427.

[2]蔡樹(shù)華，張東成，李化龍.全身熱療聯(lián)合奧沙利鉑治療中晚期原發(fā)性肝癌近期療效觀察.實(shí)用肝臟病雜志，2012，15（5）:451-452.

[3]吳玉昌.鴉膽子油乳注射液聯(lián)合放療治療鼻咽癌的療效分析.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2009，5（6）:95-96.

[4]尹紹成，石文建，趙喜慶，等.鴉膽子油乳注射液對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究.中國(guó)神經(jīng)腫瘤雜志，2012，10（1）:10-13.

[5]路廣秀，范潔宇，馬瑞蓮.鴉膽子臨床新用及研究進(jìn)展.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，34（5）:423-427.

[6]潘鎦鎦，萬(wàn)小潔，章圣輝，等.鴉膽子油乳對(duì)宮頸永生化細(xì)胞體外增殖和凋亡的作用，中國(guó)婦幼保健，2013，28:834-837.

[7]甄漢深，周燕園，袁葉飛，等.青天葵活性部位的體內(nèi)抗腫瘤作用研究.中藥材，2007，30（9）:1095-1098.

[8]李麗，馮俊，王朝莉，等.小鼠B7-H4慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)脾細(xì)胞增殖的影響.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2012，28:200-204.

[9]胡美薇，張?jiān)椒?，姚?guó)麗.鴉膽子油乳抑制人白血病多藥耐藥K562/VCR細(xì)胞株增殖的實(shí)驗(yàn)研究，浙江實(shí)用醫(yī)學(xué)，2012，17（5）:315-317.

[10]賈勇士，吳樹(shù)強(qiáng)，呂世良，等.鴉膽子油乳加放射治療中晚期食管癌的臨床分析. 中國(guó)中藥雜志，2008，33（17）:2174-2176.

[11]張宏勝.鴉膽子油乳注射液聯(lián)合化療對(duì)食管癌術(shù)后患者免疫功能的影響. 海軍醫(yī)學(xué)雜志，2007，28（1）:31-33.

[12]潘鎦鎦，萬(wàn)小潔，章圣輝，等.鴉膽子油乳對(duì)宮頸永生化細(xì)胞體外增殖和凋亡的作用.中國(guó)婦幼保健，2013，28:834-837.

[13]王慰，任桂芳，劉玉珍，等.慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化.實(shí)用肝臟病雜志，2012，15（4）:346-347.

[14]Kuss Ⅰ，Hathway B，F(xiàn)erris RL，et a1.Decreased absolute counts of T lymphocyte subsets and their relation to disease in squamous cell carcinoma of the head and neck.Clin Cancer Res，2004，10（11）:3755-3762.

[15]葛金華，曾祥銓?zhuān)B豫苞.阿德福韋酯治療HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎患者外周血T細(xì)胞亞群的變化.實(shí)用肝臟病雜志，2012，15（6）:566-567.

[16]Kruglov AA，Kuchmiy A，Grivennikov SⅠ，et a1.Physiological functions of tumor necrosis factor and the consequences of its pathologic overexpression or blockade:Mouse models.Cytokine Growth Factor Rev，2008，19:231-244.

[17]陳學(xué)彰，田華琴，黃志慶，等.肺積方對(duì)Lewis肺癌小鼠抑瘤率及EGFR、TNF-α 表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究. 中西醫(yī)結(jié)合研究，2013，5（1）:17-20.

[18]Kikuehi K，Li XH，Zheng Y，et a1.Ⅰnvasion of breast cancer cells into collagen matrix requires TGF-α and Cdc42 signaling.FEBS Lett，2011，585（2）:286-290.

[19]Kobayashi K，Kusakabe M，Okada M，et al. Ⅰmmunohistochemical localization of transforming growth factor alpha in chemically induced rat hepatocellular carcinomas with reference to differentiation and proliferation.Toxicol Pathol，2000，28:664-667.