郭月寧，王立國，王夏珍，張 薇

肝肺綜合征（hepatopulmonary syndrome，HPS）是指肺血管擴張、低氧血癥和一系列病理生理學變化及臨床表現(xiàn)。肝硬化患者最終發(fā)生肝肺綜合征的幾率高達29%，兩年半的病死率可達41%[1]。這使得找到肝肺綜合征的發(fā)病機制顯得尤為重要。但是國內(nèi)外關于HPS的發(fā)病機制尚不完全明確。有研究表明，肺血管擴張是HPS最主要的病理基礎[2]。肺血管擴張并形成分流，從而引起低氧血癥，進而形成HPS是國內(nèi)外比較一致的觀點。肺血管擴張是如何形成的成為了研究

的熱點。相關文獻顯示，在肝臟發(fā)生病變時，肝臟降解內(nèi)毒素的功能降低，形成腸源性內(nèi)毒素血癥[3]。肺臟代償性成為解毒的主要場所，內(nèi)毒素刺激肺部形成肺血管巨噬細胞，肺血管巨噬細胞促進血管擴張因子的形成，引起肺部血管的擴張，進而形成肝肺綜合征。所以，有人認為內(nèi)毒素血癥及肺血管巨噬細胞是促進肺血管擴張的主要根源。國內(nèi)、外相關文獻顯示，采用膽總管結(jié)扎法（common bile duct ligation，CBDL）制造大鼠肝肺綜合征模型是目前較成熟的方法[4]。本實驗采用CBDL法制備肝肺綜合征模型，研究動物血內(nèi)毒素水平的變化，并觀察了大鼠肺內(nèi)是否出現(xiàn)了肺血管巨噬細胞，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 購自青島派特福德白鼠養(yǎng)殖專業(yè)合作社的Wistar大鼠30只,體質(zhì)量約200～250 g。

1.2 建立肝肺綜合征模型 將大鼠在條件適宜的動物實驗室內(nèi)飼養(yǎng)。隨機將動物分為三組，即假手術組（n=10）和手術組（即膽總管結(jié)扎組，CBDL組），再將CBDL組分為 CBDL 2周組（2 wk，n=10）、CBDL 5周組（5 wk，n=10）。給予4%水合氯醛1 ml.100g-1腹腔注射麻醉。假手術組大鼠沿腹白線打開腹腔后，分離膽總管，不結(jié)扎即關腹；CBDL組用4號絲線分別在近肝門處和近十二指腸端雙線結(jié)扎膽總管后關腹。在造模后2 w及5 w時處死動物，取出肝組織和肺組織，取大塊肝、肺組織放入10%中性甲醛中固定，制成蠟塊、切片，用于HE染色。

1.3 血氣分析測定 自左心室取血3～4 ml，應用血氣分析儀（美國RADISMETER公司生產(chǎn)的ABL700型）測定PaO2和PaCO2，以此判斷肝肺綜合征的形成。

1.4 血漿中相關指標檢測 采用凝集反應法（鱟試劑）檢測血漿內(nèi)毒素（湛江博康海洋生物有限公司）；采用硝酸還原酶法測定血清NO（上海研卉生物科技有限公司）；采用ELISA法檢測TNF-α（上海研吉生物科技有限公司）。

1.5 腹部超聲檢查 使用加拿大超聲醫(yī)療技術有限公司生產(chǎn)的Sonix OP超聲診斷儀檢查膽總管擴張程度。

2 結(jié)果

2.1 血氣分析情況 在CBDL 5 wk組，動物血PaO2明顯低于假手術組（P<0.05），符合HPS特征性動脈血氣變化（表1）。

表1 各組血氣分析結(jié)果（±s）

表1 各組血氣分析結(jié)果（±s）

與假手術組比，①P<0.05

?

2.2 血漿內(nèi)毒素、NO和TNF-α水平的變化 CBDL 5 wk組動物血漿內(nèi)毒素、NO水平和TNF-α水平明顯高于假手術組（P<0.05，表2）。

表2 血漿內(nèi)毒素、NO和TNF-α水平（±s）的變化

表2 血漿內(nèi)毒素、NO和TNF-α水平（±s）的變化

與假手術組比，①P<0.05

?

2.3 膽總管擴張情況 CBDL 5 wk動物膽總管比假手術組或CBDL 2 wk組明顯擴張（圖1），而CBDL 2 wk組與假手術組比，變化不明顯（圖2）。

圖1 腹部超聲表現(xiàn) CBDL 5 wk組大鼠膽總管明顯擴張

圖2 腹部超聲表現(xiàn) 假手術組動物膽總管無明顯擴張

2.4 肝、肺組織病理學變化 大體觀察可見CBDL 2 wk大鼠肝臟變大，淡黃色，邊緣不銳利；在膽總管結(jié)扎后5 wk，大鼠肝臟腫大，顏色加深，表面存在黃色小結(jié)節(jié)。在顯微鏡下觀察，CBDL 2 wk動物肝臟匯管區(qū)小膽管擴張，細胞呈灶狀壞死，血管周圍有大量炎細胞聚集（圖3）；CBDL 5 wk組動物上述變化更加明顯，周圍結(jié)締組織出現(xiàn)增生并且分隔，肝細胞排列紊亂，細胞融合，細胞核固縮，部分肝細胞融解消失，形成空泡（圖4）。CBDL 5 wk組肺組織可見廣泛充血，炎性細胞浸潤，毛細血管擴張（圖5），且出現(xiàn)肺血管巨噬細胞（圖6）。假手術組肝肺組織無明顯變化。

圖3 肝組織病理學變化 在膽總管結(jié)扎2 wk后，肝臟炎癥細胞聚集、浸潤（HE，400×）

圖4 肝組織病理學變化 CBDL 5 wk組動物肝細胞排列紊亂，細胞融合，細胞核固縮，結(jié)締組織增生（HE，400×）

圖5 肺組織病理學表現(xiàn) CBDL 5 wk組動物肺組織可見廣泛充血，炎性細胞浸潤，毛細血管擴張（HE，400×）

圖6 肺組織病理學表現(xiàn) CBDL 5 wk組動物肺血管內(nèi)出現(xiàn)巨噬細胞（HE，100×）

3 討論

HPS是在慢性肝病及門靜脈高壓的基礎上出現(xiàn)的動脈血氧合功能異常、肺血管擴張等一系列表現(xiàn)，在臨床上主要以進行性呼吸困難、低氧血癥為主要表現(xiàn)[1]。多數(shù)研究表明肝肺綜合征的本質(zhì)是肝病時發(fā)生了肺血管擴張及肺動脈氧合功能降低，而引起低氧血癥[5]。

關于HPS的發(fā)病機制尚不完全明確，而肺血管擴張是引起肺通氣/灌注不匹配，出現(xiàn)低氧血癥的主要原因[6]，這一點在國內(nèi)外均較為認同。肺血管擴張在肝肺綜合征形成中起到關鍵性作用。肺血管擴張機制較為復雜。大量實驗研究表明，可能是由于肺血管內(nèi)的縮血管活性因子與擴血管活性因子之間的失衡所導致的[7]。關于肺血管內(nèi)擴張活性因子，如NO等的生成，有相關研究顯示是由于肝臟功能下降，消除內(nèi)毒素水平降低，使得內(nèi)毒素入血，進而誘導肺血管內(nèi)形成巨噬細胞，肺血管巨噬細胞吞噬了血液中的異物后分泌所生成的[8]。

本實驗旨在研究內(nèi)毒素及肺血管內(nèi)巨噬細胞在肺血管擴張中的作用，從而更進一步研究肝肺綜合征的發(fā)生機制，為臨床診治提供更好的依據(jù)。

內(nèi)毒素是導致感染性休克的最重要的生物因子。主要的作用靶細胞之一為內(nèi)皮細胞，最易受到攻擊的靶器官是肺和腸[9]。內(nèi)毒素本身可導致細胞自溶，由此形成腸源性內(nèi)毒素血癥和腸粘膜通透性之間的惡性循環(huán)。內(nèi)毒素的作用越來越受到重視[10]。最近研究證明，肝硬化大鼠細菌異位與HPS密切相關，在HPS發(fā)生時存在菌血癥和腸源性內(nèi)毒素血癥，內(nèi)毒素能誘導機體產(chǎn)生肺血管巨噬細胞，促進炎性細胞在肺血管內(nèi)皮細胞粘附聚集，引起肺炎癥反應。本實驗在膽總管結(jié)扎2 wk和5 wk觀察，動物血內(nèi)毒素水平隨著時間的延長而逐步升高，充分說明其在肝肺綜合征形成過程中的重要作用。

在正常大鼠肺內(nèi)是沒有巨噬細胞的[11]。已有研究證明，在內(nèi)毒素誘導肺急性損傷時可導致肺泡毛細血管通透性增加，促進巨噬細胞在肺內(nèi)聚集，導致大量炎癥因子釋放。研究發(fā)現(xiàn)HPS大鼠肺內(nèi)聚集大量的巨噬細胞。肺血管巨噬細胞吞噬功能增強,清除血液中的腸道菌群和內(nèi)毒素,同時分泌大量的血管活性物質(zhì),包括 NO、TNF-α[12]、ET-1等，引起肺血管擴張[13]。相關研究證實，應用抑制TNF-α的制劑可以抑制腸道細菌易位，減少腸道細菌的過度生長，有效地預防HPS的發(fā)生[14]。本研究顯示，在肝肺綜合征形成過程中NO、TNF-α水平明顯升高，說明內(nèi)毒素刺激肺血管巨噬細胞形成并分泌了擴血管活性因子，促進肺血管擴張，進而形成了肝肺綜合征。

CBDL大鼠可較好地復制HPS模型，并被廣泛應用于實驗研究[15]。本實驗創(chuàng)新點之一為在結(jié)扎膽總管時，并不對膽總管進行剪斷，減少了膽總管內(nèi)膽汁對腹腔的刺激。在本研究中，動物在結(jié)扎膽總管后，隨著時間的延長，發(fā)現(xiàn)大鼠肝臟逐漸變大，顏色由淡黃到灰黃色，質(zhì)地逐漸變硬，直至肝表面出現(xiàn)黃色小結(jié)節(jié)；在顯微鏡下觀察肝臟匯管區(qū)小膽管擴張，肝細胞灶狀壞死。動物血PaCO2、PaO2出現(xiàn)相應的病理生理學改變，NO等明顯升高，證明CBDL模型建立成功。本實驗的另一創(chuàng)新點為動脈血的采集。大鼠的腹主動脈在進針后易破裂，血流出后使腹腔視野變得模糊，影響肝組織的留取。經(jīng)左心室取血，手術較容易，且不易破裂，采血量能夠達到血氣分析的要求。

本實驗中增加了對大鼠肝臟及結(jié)扎膽總管進行彩色多普勒超聲檢查，以便于密切關注造模情況，對于觀察模型的建造成功起到了監(jiān)測作用。

肺血管擴張是HPS發(fā)病機制中出現(xiàn)低氧血癥的主要原因。本實驗中CBDL組在肝臟發(fā)生病理變化的同時，肺組織出現(xiàn)毛細血管擴張，說明肺內(nèi)毛細血管擴張與肝肺綜合征的形成有關。檢測動脈血PaO2進行性下降，證明肺血管擴張是導致低氧血癥的原因。

本實驗證明，在肝肺綜合征形成過程中，內(nèi)毒素起到關鍵性的重要作用，它可以刺激大鼠體內(nèi)肺血管巨噬細胞的生成，進而由肺血管巨噬細胞分泌擴血管活性因子如NO等，使得肺血管出現(xiàn)擴張，形成低氧血癥，進而形成肝肺綜合征。但關于肺血管巨噬細胞是通過哪些信號傳導途徑引起擴血管活性因子分泌的，到現(xiàn)在仍不是很清楚，下一步實驗將進一步探討。

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