李曉梅，孫寶存，劉 奮，羅漣榮，宋洪運(yùn)，趙志全，姚景春

酒精性肝病是由于長期大量飲酒導(dǎo)致的肝臟疾病。在疾病初期，通常表現(xiàn)為酒精性脂肪肝，進(jìn)而可發(fā)展成酒精性肝炎、肝纖維化和肝硬化。國內(nèi)外已有文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)酒精性肝病的腸道屏障功能（intestinal barrier function，IBF）變化[1]。IBF在酒精性肝病發(fā)病中的作用機(jī)制已經(jīng)得到證實(shí)。Keshanarzian et al[2]報(bào)道，酒精可致IBF障礙，使小腸黏膜通透性增加，腸源性內(nèi)毒素滲漏形成腸源性內(nèi)毒素血癥（Intestinal endotoxemia，IETM），對肝臟造成“二次打擊”，加重肝損傷。我們觀察了酒精性脂肪肝大鼠腸道屏障功能及肝組織病理學(xué)改變，以及化滯柔肝顆粒的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑 6周齡SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量為250～350 g（魯南制藥集團(tuán)股份有限公司實(shí)驗(yàn)動物中心提供）；56%（V/V）北京紅星二鍋頭白酒為市售產(chǎn)品；乳果糖口服溶液為荷蘭蘇威制藥生產(chǎn)；甘露醇為山東辰欣藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；護(hù)肝片為黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司提供；化滯柔肝顆粒（由茵陳、決明子、大黃、澤瀉、豬苓、山楂、蒼術(shù)、白術(shù)等16味中藥組方而成）由山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司提供。

1.2 模型制備 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)將60只大鼠分為正常對照組（A組）、模型組（B組）、小劑量化滯柔肝組（C組，1.1 g·kg-1d-1）、中劑量化滯柔肝組（D組，2.2 g·kg-1d-1）、大劑量化滯柔肝組（E組，4.4 g·kg-1d-1）和護(hù)肝片陽性對照組（F組，0.4 g·kg-1d-1），每組10只。A組用蒸餾水灌胃，其余組上午給予56%紅星二鍋頭10 ml·kg-1d-1灌胃，下午給予相應(yīng)的藥物灌胃，持續(xù)5周。于最后一次灌胃后24 h，用2%戊巴比妥鈉40 mg·kg-1經(jīng)尾靜脈注射麻醉，心臟采血3 ml，用于血生化檢測；在無菌條件下打開腹腔，暴露內(nèi)臟，取出肝臟和腸系膜淋巴結(jié)復(fù)合體（mesenteric lymph node complex，MLN），稱其質(zhì)量后用于腸道細(xì)菌移位（bacterial translocation，BT）的檢測；取末端回腸行組織病理學(xué)檢查。

1.3 腸道BT的檢測 取腸系膜根部淋巴結(jié)數(shù)枚，約500 mg，加2 ml生理鹽水，剪碎，迅速放入準(zhǔn)備好的無菌肉湯試管中培養(yǎng)24 h，然后各吸取200μl肉湯，分別接種在BBC血平板培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果，計(jì)算各組細(xì)菌移位率（移位陽性動物個(gè)數(shù)/該組動物總數(shù)×100%）。按照國際通用標(biāo)準(zhǔn)，菌落數(shù)>100菌落/克淋巴結(jié)組織即為細(xì)菌陽性。

1.4 腸道通透性的檢測 在造模四周時(shí)，即第28天早晨給予所有試驗(yàn)大鼠乳果糖和甘露醇混合液灌胃一次，每份灌胃樣本為乳果糖（100 mg）和甘露醇（50 mg）溶于2 ml生理鹽水中，利用代謝籠收集6 h尿液，-20℃保存。用高效液相色譜儀（美國Waters e2695-2414）測定尿中乳果糖和甘露醇濃度，計(jì)算各自的排出率，以乳果糖（lactulose，L）/甘露醇（mannitol，M）排出率（L/M%）表示腸道通透性。

1.5 血生化的檢測 采用深圳邁瑞生物醫(yī)療股份有限公司生產(chǎn)的BS-200全自動生化分析儀測定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s）表示，采用單因素方差分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腸道BT、L/M及肝質(zhì)量指數(shù)的變化 與對照組相比，模型組動物腸道BT顯著升高（P<0.01），L/M比值升高（P<0.05），肝質(zhì)量指數(shù)顯著升高（P<0.001）；與模型組相比，小劑量化滯柔肝組腸道BT有下降趨勢，L/M比值下降（P<0.05），肝質(zhì)量指數(shù)下降（P<0.05）；中劑量化滯柔肝組及大劑量化滯柔肝組腸道BT均下降（P<0.05），L/M比值和肝質(zhì)量指數(shù)顯著低于模型組（P<0.01）；陽性對照組腸道BT及L/M比值降低（P<0.05），肝質(zhì)量指數(shù)顯著低于模型組（P<0.01），見表1。

2.2 各實(shí)驗(yàn)組大鼠血生化指標(biāo)的變化 與對照組相比，模型組動物血ALT、AST有升高趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，ALP水平顯著升高（P<0.05）；小劑量化滯柔肝組ALT、AST和ALP水平與模型組相比均有下降趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與模型組相比，中劑量化滯柔肝組和大劑量化滯柔肝組ALT、AST和ALP水平均顯著降低（P<0.05）。各試驗(yàn)組大鼠血T-BIL水平均無顯著性變化，見表2。

表1 各組大鼠腸道BT、L/M和肝質(zhì)量指數(shù)（±s）的比較

表1 各組大鼠腸道BT、L/M和肝質(zhì)量指數(shù)（±s）的比較

與 B組比，①P<0.05；②P<0.01；③P<0.001

肝質(zhì)量指數(shù)（%）A組 1013.6±0.4③B組 1074.3±0.6 C組 933.8±0.3①D組 1013.7±0.3②E組 923.6±0.2②只數(shù) 細(xì)菌移位BT（%）10.0②70.033.310.0①22.2①L/M（%）0.23±0.07①0.38±0.20.27±0.06①0.22±0.2②0.18±0.07②

表2 各組大鼠血生化指標(biāo)（±s）的比較

表2 各組大鼠血生化指標(biāo)（±s）的比較

與B組比，①P<0.05

ALT（U/L）AST（U/L）ALP（IU/L）T-BIL（μmol/L）A組 48.7±2.7135.4±18.7306.4±67.1① 2.5±0.9 B組 54.1±17.2163.2±67.5427.1±126.62.5±0.7 C組 44.0±8.4128.8±41.6439.4±62.91.8±0.9 D組 39.8±5.0① 113.4±38.3① 334.4±47.6① 2.5±0.6 E組 40.8±5.6① 111.2±28.9① 350.2±112.2① 2.6±0.7 F組 50.4±15.4142.8±42.9268.2±63.5② 2.0±0.6

2.3 肝組織病理學(xué)表現(xiàn)變化 大體觀察，對照組大鼠肝臟色澤鮮紅、邊緣銳利、質(zhì)地柔韌而富有彈性，被膜光澤；模型組大鼠肝臟外觀呈彌漫性腫大，邊緣稍鈍，有油膩感，壓迫時(shí)可出現(xiàn)凹陷，表面色澤較蒼白,部分略帶灰黃色。切面呈淡黃色，甚至蒼白色；小劑量化滯柔肝組及護(hù)肝片組肝臟表面顏色略黃，觸之有油膩感，質(zhì)地較柔韌；中劑量及大劑量組肝臟表面顏色略黃，質(zhì)地較柔韌，彈性可。

在光鏡下，對照組動物肝臟肝小葉及肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)無脂肪變性、炎癥和壞死，肝細(xì)胞索排列整齊（圖1）；模型組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝小葉Ⅰ、Ⅱ帶區(qū)內(nèi)見肝細(xì)胞胞漿疏松（部分呈氣球樣變）、偶見肝細(xì)胞灶性壞死并伴少量淋巴細(xì)胞浸潤，肝小葉Ⅱ帶區(qū)還可見肝細(xì)胞呈小空泡性變（輕度脂肪變），個(gè)別動物肝竇擴(kuò)張淤血（圖2）；小劑量化滯柔肝組動物肝板結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞內(nèi)充滿大小不一的脂滴。細(xì)胞核被擠向一邊。肝細(xì)胞的脂肪變性呈彌漫性改變（圖3）；中劑量化滯柔肝組動物肝臟肝板結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞內(nèi)充滿大小不一的脂滴。肝細(xì)胞脂肪變性呈小片狀改變（圖4）；大劑量化滯柔肝組肝板結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞內(nèi)充滿大小不一的脂滴。肝細(xì)胞脂肪變性呈點(diǎn)灶狀改變（圖5）；護(hù)肝片組動物肝臟肝板結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞內(nèi)充滿小脂滴。肝細(xì)胞脂肪變性呈小片狀改變（圖6）。

圖1 對照組大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn) 結(jié)構(gòu)正常（HE，400×）

圖2 酒精性脂肪肝大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn) 肝細(xì)胞濁腫（HE，400×）

圖3 小劑量化滯柔肝組大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn) 肝細(xì)胞濁腫，輕度脂肪變（HE，400×）

圖4 中劑量化滯柔肝組大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn) 肝細(xì)胞輕度脂肪變（HE，400×）

圖5 大劑量化滯柔肝組大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn) 肝細(xì)胞灶性脂肪變（HE，400×）

圖6 護(hù)肝片組大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn) 肝細(xì)胞輕度脂肪變（HE，400×）

2.4 回腸組織病理學(xué)表現(xiàn) 大體觀察各組大鼠回腸黏膜色澤正常，均未見糜爛、出血及潰瘍等改變。在光鏡下對各組末端回腸黏膜損傷程度進(jìn)行分析，均未見黏膜損傷、炎癥及充血等改變。

3 討論

酒精性脂肪肝病位在肝，有關(guān)中醫(yī)藥防治酒精性脂肪肝的研究大多圍繞“肝臟”這一“本臟”的形態(tài)和功能變化而展開[3，4]。鑒于中醫(yī)學(xué)理論臟腑聯(lián)系的整體觀及中藥復(fù)方的多途徑藥理作用[5]，特別是近年來現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對酒精性脂肪肝病理機(jī)制的不斷深入研究所揭示的“臟腑聯(lián)系”[6]，所以在臨床治療和研究過程中，需要重視相關(guān)臟腑的變化及其意義。本試驗(yàn)結(jié)果表明酒精性脂肪肝大鼠腸道通透性顯著增加，這是因?yàn)橐掖纪ㄟ^激活肌球蛋白輕鏈激酶使細(xì)胞間緊密連接發(fā)生改變，乙醇代謝過程中產(chǎn)生的乙醛通過抑制酪氨酸磷酸酯酶，引起緊密連接蛋白酪氨酸磷酸化，進(jìn)而重組細(xì)胞間隙處的緊密連接蛋白，破壞細(xì)胞間緊密連接，增加細(xì)胞通透性[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化滯柔肝顆粒可以顯著改善酒精性脂肪肝大鼠的腸道通透性，表明化滯柔肝顆?？梢砸种凭凭鸬哪c通透性增加，減輕內(nèi)毒素滲漏，從而減輕脂肪肝和肝損傷。

研究發(fā)現(xiàn)，酒精性脂肪肝患者中存在小腸細(xì)菌過度生長[8，9]。嗜酒者胃酸減少，胃液pH值增高，殺菌作用減弱，使細(xì)菌進(jìn)入小腸過多，從而引起腸道細(xì)菌，尤其是革蘭氏陰性桿菌過度生長[10，11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明酒精性脂肪肝大鼠腸道移位率明顯高于正常組，這與其它研究發(fā)現(xiàn)一致。中劑量和大劑量化滯柔肝藥物可以顯著降低酒精性脂肪肝大鼠腸道細(xì)菌移位率。

酒精性脂肪肝患者血ALT和AST可輕微異常[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示酒精性脂肪肝模型大鼠血ALT和AST水平高于正常組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與臨床一致?；瘻岣晤w?？梢燥@著降低大鼠血清ALT和AST水平。

中醫(yī)對于酒精性肝病有傷酒、脅痛、酒癖、酒疸和酒臌等病名，認(rèn)為飲酒為外因，而素體稟賦不足、脾胃虛弱為內(nèi)因，健脾等調(diào)理脾胃運(yùn)化功能的治療方法是臨床治療酒精性肝病的基本治法治則。嗜酒者損傷脾胃，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，脾主運(yùn)化水谷精微，主升清，為后天之本；小腸主盛化物，泌別清濁。其“泌別”功能與“腸道屏障”，“清濁”與“菌群內(nèi)毒素”可謂具高度一致性[13～16]?；瘻岣晤w粒中的蒼術(shù)、白術(shù)、陳皮均有補(bǔ)裨益胃、祛濕化濁的作用。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)化滯柔肝顆粒通過改善腸道屏障功能，對酒精所致的酒精性脂肪肝大鼠肝臟炎癥及主要誘發(fā)因素均有一定的改善作用。因此，化滯柔肝顆粒對于預(yù)防或治療酒精性脂肪肝可能具有一定的價(jià)值，值得進(jìn)行臨床驗(yàn)證。

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