于慧杰，盛國光

成功建立肝損傷動物模型是探究肝炎發(fā)生機制及其治療藥物的重要工具[1，2]。1992年，Tiegs用伴刀豆球蛋白A（Con A）建立了較為接近自身免疫性肝病及病毒性肝炎免疫損害的肝損傷模型[3]，被認為是適合研究人類病毒性肝炎和自身免疫性肝病等肝臟疾病的合適模型[4]。免疫性肝炎動物模型的病理改變及肝細胞損傷機制均與病毒性肝炎相類似,免疫性肝炎通常由生物性因素等引起,常見的原因為病毒感染,如臨床上HBV、丙型肝炎病毒等病毒的感染,其重要的特征是肝組織內(nèi)大量的炎細胞浸潤，產(chǎn)生免疫/炎癥應答,導致免疫反應為基礎的肝損傷，即為免疫性肝炎。免疫性肝炎是肝纖維化、肝硬化乃至肝臟腫瘤等終末病變發(fā)生發(fā)展的重要因素之一[5]。

與其他肝損傷模型如四氯化碳模型、卡介苗加脂多糖（BCG+LPS）模型相比，ConA所建立的肝損傷模型被認為更適合用來進行病毒性肝炎、自身免疫性肝病等病理機制的研究。且用ConA建立肝損傷模型具有操作簡便，無需提前致敏的特點，因此目前在建立肝損傷模型時ConA更為常用[6]。雖然目前已有學者對ConA不同用量或使用不同品系小鼠建立的肝損傷進行過探討[7]，但對于ConA的建模應用劑量并沒有統(tǒng)一的標準，且存在造模藥物干預時間不一致，實驗結(jié)果差異大等問題。本文以C57BL/6J小鼠、BABL/c小鼠和KM小鼠三種常用品系的實驗小鼠作為研究對象，觀察了幾種常用造模劑量的ConA造成的肝損傷情況，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 雄性KM小鼠、BABL/c小鼠和C57BL/6J小鼠各50只，4～5周齡,體質(zhì)量18～22 g，由武漢大學動物實驗中心提供【許可證號：SCXK（鄂）2008-0004】。實驗動物由湖北省中醫(yī)院實驗動物中心飼養(yǎng)，恒溫恒濕，標準飼料，自由飲水。ConA（IV型,100mg/支，批號80M7680V）購于Sigma公司。檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒購于南京建成生物工程研究所（批號依次為 20120410、20120412）。

1.2 急性肝損傷模型的制備 根據(jù)Con A的用量分為5組，每組30只，三種品系的小鼠各10只。A組為空白對照組；B組應用Con A 6mg.kg-1；C組為Con A 12 mg.kg-1；D組為 Con A 20 mg.kg-1；E組為 Con A 30 mg.kg-1。在實驗開始時，A組小鼠經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水，其余各組小鼠分別通過尾靜脈注射不同劑量的Con A。在經(jīng)尾靜脈注射8 h后，摘眼球取血，室溫靜置30 min，3000 r/m，離心15 min，分離血清。按試劑盒說明測定血清ALT和AST水平。脫頸椎處死小鼠，各組小鼠取肝組織，在4℃生理鹽水中漂洗,除去血液,濾紙拭干,稱取肝組織和脾組織，稱質(zhì)量后計算臟器指數(shù)。其中肝指數(shù)=肝質(zhì)量（g）/體質(zhì)量×100%，脾指數(shù)=脾質(zhì)量（g）/體質(zhì)量×100%。取部分肝組織，置入4%中性多聚甲醛中固定，石蠟包埋、制成4μm連續(xù)切片后，固定在玻片上，行常規(guī)HE染色，在光學顯微鏡下觀察肝組織病理學改變。以小鼠肝組織出現(xiàn)病理學改變和血清ALT水平超過正常值上限2倍以上作為造模成功的標準。

1.3 統(tǒng)計方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以（±s）表示，各組數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布分析和方差齊性檢驗，采用方差分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 在尾靜脈注射前各組小鼠一般情況較好，毛發(fā)光澤度較好，進食、飲水正常，活動度好。在尾靜脈注射后，A組小鼠和B組小鼠活動度未見明顯異常；C組BABL/c小鼠和C57BL/6J小鼠分別出現(xiàn)2只死亡，其余小鼠出現(xiàn)精神萎靡，活動減少，蜷臥、抱團；在D組KM小鼠中死亡1只，BABL/c小鼠死亡4只，C57BL/6J小鼠死亡5只，未死亡小鼠出現(xiàn)精神萎靡，活動減少，蜷臥、抱團，豎毛；E組KM小鼠死亡3只，7只未死亡小鼠出現(xiàn)精神萎靡，蜷臥、抱團，活動減少，豎毛。BABL/c小鼠和C57BL/6J小鼠全部死亡。

2.2 不同ConA用量動物血清轉(zhuǎn)氨酶及肝脾指數(shù)的變化 見表1。

2.3 肝組織病理學變化 A組小鼠肝臟組織未見明顯異常，在HE染色中肝細胞漿均勻紅染，細胞核大小正常，核質(zhì)淡染，肝竇清晰可見，肝索排列整齊；B、C、D、E組肝組織均出現(xiàn)不同程度的病變，肝板排列紊亂，呈氣球樣變或嗜酸性變，可見明顯的點狀壞死，灶性壞死甚至大片狀壞死，肝組織內(nèi)大量淋巴細胞浸潤，尤其是匯管區(qū)少量淋巴細胞、粒細胞存在，肝竇內(nèi)大量紅細胞淤積，肝板消失。血管周圍的肝細胞胞漿疏松，染色變淺，肝竇間隙明顯增寬，肝索消失，有的還可見點狀壞死、淋巴細胞、中性粒細胞浸潤，見圖1～4。

表1 各組不同品系小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶及肝脾指數(shù)（±s）的變化

表1 各組不同品系小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶及肝脾指數(shù)（±s）的變化

與同組KM小鼠比，①P＜0.05

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圖1 肝組織病理學表現(xiàn) KM小鼠在注射ConA 6 mg·kg-1后，可見肝組織匯管區(qū)炎細胞浸潤，肝細胞腫脹，呈氣球樣變（HE，400Χ）

圖2 肝組織病理學表現(xiàn) KM小鼠在注射ConA 12 mg·kg-1后，可見炎細胞浸潤，肝細胞腫脹，呈氣球樣變，片狀壞死（HE，400Χ）

圖3 肝組織病理學表現(xiàn) KM小鼠在注射ConA 20 mg·kg-1后，可見肝板消失，肝細胞排列紊亂，肝細胞形態(tài)消失，炎細胞浸潤，肝組織出現(xiàn)淤血（HE，400Χ）

圖4 肝組織病理學表現(xiàn) KM小鼠在注射ConA 30mg·kg-1后，可見肝板消失，肝細胞排列紊亂，肝細胞形態(tài)消失，炎細胞浸潤，淤血進一步加重（HE，400Χ）

3 討論

ConA是從JACK豆中提取出的一種植物蛋白質(zhì)，是一種T細胞絲裂原，也是一種可以與多種細胞表面糖分子殘基結(jié)合的蛋白分子[8]，在pH中性的條件下以四聚體的形式存在，分子量為104000。ConA誘導的免疫性肝損傷模型適合研究病毒性肝炎的病理學發(fā)病機制和保護肝損傷藥物的研究。現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，自身免疫性肝病、病毒性肝炎等所致的肝損害均與T淋巴細胞的活化密切相關[9]。ConA可作為有絲分裂刺激原，激活T淋巴細胞、巨噬細胞等釋放多種細胞因子，從而引起肝損傷[10]。國外有研究報道小鼠靜脈注射ConA 8～12小時可引起明顯的急性肝損害[11]，故本次實驗研究選擇尾靜脈注射8小時后進行觀察。

ConA誘導的肝損傷能夠模擬免疫相關肝病時T細胞依賴免疫反應，其特點是由CD4+T細胞增多所介導的免疫損傷[12]。尾靜脈注射ConA能夠引起以輔助性T細胞和巨噬細胞為主要效應細胞的特異性肝損傷[13]，其作用機制為：肝竇內(nèi)存在大量的巨噬細胞,激活后產(chǎn)生細胞因子可直接損傷肝細胞；其次，大量活化T淋巴細胞存在于脾臟，并產(chǎn)生細胞因子（如TNF-α、IL-2、INF-γ等），T細胞與細胞因子隨血液運行到肝臟，與肝細胞接觸或進一步激活巨噬細胞，破壞血管內(nèi)皮細胞，導致肝損傷[14]。

本研究結(jié)果表明，Con A引起的肝臟損傷主要表現(xiàn)為肝臟和脾臟質(zhì)量增加、淤血，血清轉(zhuǎn)氨酶（ALT和AST）水平急劇升高。ConA劑量越大，轉(zhuǎn)氨酶上升越高。當肝細胞有實質(zhì)性損害時,可因肝細胞壞死、細胞膜通透性增加，細胞內(nèi)相應的酶釋放入血，故血中酶活性增高。肝組織出現(xiàn)大面積灶狀壞死，肝臟、脾臟體積增大，故ConA干預的各組肝脾指數(shù)均高于對照組。

該實驗還可以看出在此肝損傷模型中，脾病變可能先于肝臟，與李敏等[15]提出的“脾內(nèi)活化的T淋巴細胞隨血流到達肝臟,直接或進一步激活巨噬細胞，產(chǎn)生細胞因子引起的損傷”相吻合。

遺傳體質(zhì)是藥物代謝和效應的決定性因素[16]，在異卵雙生子中香豆素半衰期的變異程度比同卵雙生子高6～22倍。遺傳多態(tài)性藥物代謝酶、轉(zhuǎn)運蛋白和受體的遺傳多態(tài)性是導致藥物反應差異的重要原因。遺傳多態(tài)性是一種孟德爾單基因性狀，由同一基因位點上具有多種等位基因引起，并由此導致多種表型。

中醫(yī)學理論認為，體質(zhì)是由遺傳或獲得性因素所決定的表現(xiàn)在形態(tài)結(jié)構、生理機能和心理活動方面綜合的相對穩(wěn)定的特質(zhì)。體質(zhì)的差異在很大程度上決定著疾病的發(fā)生、發(fā)展、變化[17]。陳小野等[18]通過觀察4種小鼠的寒、熱體質(zhì)發(fā)現(xiàn)，KM、BABL/c、C57BL/6J三種小鼠寒性體質(zhì)存在差異：在4～5周齡時昆明小鼠體質(zhì)明顯偏熱；BALB/c小鼠與C57BL/6J小鼠體質(zhì)偏寒。體質(zhì)因素可能也是造成不同品系小鼠對ConA反應差異的原因之一。

當然，也不排除因小鼠品系不同，不同品系小鼠的正常參考值也存在差異的情況，此前胡建武等[19]對ICR小鼠、C3H小鼠、KM小鼠等10種常見的SPF級實驗大、小鼠血液學及生化指標的正常參考值進行了探討，雖然未包括BABL/c小鼠和C57BL/6J小鼠，但就ALT、AST兩項指標看，10種常用實驗用鼠間存在一定的差異。本實驗設置空白對照組，觀察未用ConA處理的三個品系的小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶的變化，結(jié)果它們之間的差異無統(tǒng)計學意義。

由本實驗我們可以得出以下結(jié)論，當同一藥物作用于不同品系的實驗動物時，其結(jié)果可能由于動物品系的不同而產(chǎn)生差異，因此在建立實驗模型選擇實驗動物時應當慎重。尤其在使用轉(zhuǎn)基因動物或基因敲除等價格較為昂貴的實驗動物進行實驗研究時，應盡量采用品系相同的動物進行相關預實驗，以避免因品系不同造成的實驗結(jié)果的差異。

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