屈耀寧，董 蕾，史海濤，秦 斌，劉亞萍

因大量飲酒導(dǎo)致的酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）在西方國家是導(dǎo)致死亡的主要疾病之一[1]。在我國，ALD的發(fā)病也呈逐漸增長的趨勢。據(jù)調(diào)查，1982年我國成人嗜酒者為0.21%，1991年北京市16個(gè)縣區(qū)調(diào)查結(jié)果為14.3%，2000年浙江地區(qū)調(diào)查結(jié)果為14.8%，西安地區(qū)飲酒者占35.1%[2]。乙醇在肝內(nèi)通過細(xì)胞質(zhì)乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH)、微粒體細(xì)胞色素 P4502E1（CYP2E1）和過氧化物酶代謝，其中ADH和CYP2E1是乙醇代謝的主要酶類[3]。乙醇在肝內(nèi)代謝主要通過胞漿中ADH途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的微粒體乙醇氧化系統(tǒng)（MEOS）途徑，生成乙醛，再經(jīng)過乙醛脫氫酶生成乙酸，代謝為水和二氧化碳。在MEOS途徑中CYP2E1活化產(chǎn)生的活性氧基團(tuán)（ROS）是損傷肝臟的主要原因之一[4]。過氧化物酶增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor alpha，PPAR-α）是近年來廣泛研究的調(diào)控脂肪酸轉(zhuǎn)化和氧化的核轉(zhuǎn)錄因子[5]，能有效地調(diào)控炎性因子的表達(dá)及氧化應(yīng)激反應(yīng)，參與酒精性肝損傷的發(fā)展過程并發(fā)揮關(guān)鍵性作用。目前，關(guān)于己酮可可堿（pentoxifylline，PTX）對ALD的治療作用研究已有報(bào)道，但大多僅限于臨床觀察，很少涉及作用機(jī)制方面的研究。為了進(jìn)一步探討PTX對ALD的防治作用，我們制備了酒精誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠ALD模型，檢測小鼠血清 ADH、CYP2E1酶活性和肝組織 ADH、CYP2E1、PPAR-α mRNA水平，以及肝組織CYP2E1和PPAR-α蛋白表達(dá)，以探討PTX對ALD的作用。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級雌性C57BL/6小鼠64只，體質(zhì)量（20±4）g，由我校動物中心提供。室溫保持在（22±2）℃，相對濕度為65%，按正常晝夜節(jié)律調(diào)整光照時(shí)間。

1.2 急性酒精性肝損傷模型的制備 取28只小鼠，隨機(jī)分為模型組、治療組和正常組，每組8～10只。治療組動物提前7天給予PTX（Sigma公司 P1784-10G）100 mg·kg-1體質(zhì)量腹腔注射，1次/d；模型組和正常組動物給予等量0.9%生理鹽水腹腔注射。7天后，給予模型組和治療組動物50%乙醇12 ml·kg-1體質(zhì)量灌胃，q12h，連續(xù)3次[6]；給予正常組等量5%葡萄糖溶液灌胃。在灌胃結(jié)束后，隨機(jī)處死模型組動物2只，取肝組織行病理學(xué)檢查。在光鏡下見肝小葉大量炎細(xì)胞浸潤，并有空泡和肝細(xì)胞壞死，證明模型建立成功。

1.3 慢性酒精性肝炎模型的制備 取36只小鼠，隨機(jī)分為模型組、小劑量、大劑量治療組和正常組，每組8～10只。分別給予治療組動物PTX 50 mg·kg-1體質(zhì)量和150 mg·kg-1體質(zhì)量腹腔注射，1次/d，給予模型組和正常組等量0.9%生理鹽水腹腔注射。2 h后，給予模型組、小劑量和大劑量治療組動物10%乙醇10 ml·kg-1體質(zhì)量灌胃，1次 /d，1周后，給予20%乙醇 10 ml·kg-1體質(zhì)量灌胃，1次 /d，參考文獻(xiàn)[7]，給予正常組等量5%葡萄糖溶液灌胃，造模及給藥時(shí)間均為6周。6周后，隨機(jī)處死模型組動物2只，行病理學(xué)檢查證明模型建立成功。造模及給藥結(jié)束后，小鼠禁食不禁水12 h，眼球采血，分離血清，保存于-20℃。采取脫臼法處死小鼠，取肝臟右葉于無菌凍存管，經(jīng)液氮罐轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。取肝左葉置于甲醛液中固定，行病理學(xué)檢查。

1.4 血清ADH和CYP2E1活性測定 采用比色法檢測（南京建成科技有限公司提供試劑，批號A083-1 GMS18021.1）。

1.5 肝組織 ADH、CYP2E1和 PPAR-α mRNA水平測定 取肝組織塊各約5 mg，用試劑盒RNAfast200（上海飛捷生物技術(shù)有限公司 Catalog no.220010）提取總RNA,采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa Biotechnology）反轉(zhuǎn)錄為cDNA。由北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司設(shè)計(jì)并合成引物（表1）。mRNA水平和對照組無明顯差異（P>0.05）；在急性和慢性酒精性肝炎小鼠肝組織CYP2E1 mRNA水平明顯增高，與對照組相比有顯著性差異（P<0.01），而治療組比模型組明顯降低（P<0.01）；在急性酒精性肝炎、治療組和對照組小鼠肝組織PPAR-α mRNA水平無顯著性差異（P>0.05），慢性酒精性肝炎小鼠肝組織PPAR-α mRNA水平降低，與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖1、2）。

表1 引物序列

圖1 急性肝損傷小鼠肝組織ADH、CYP2E1和PPAR-αmRNA水平

1.6 肝組織CYP2E1和PPAR-α蛋白表達(dá)檢測 采用免疫組化法。經(jīng)過脫蠟、抗原修復(fù)、封閉、加一抗（1:100，博士德生物 BA1774 BA1691），4°過夜，加二抗（中杉金橋SP-9000/9001/9002），顯色，蘇木素復(fù)染、封片。陽性染色細(xì)胞為胞漿和/或胞膜出現(xiàn)黃褐色物質(zhì)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.01為有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 小鼠血清ADH和CYP2E1活性變化 見表2。

表2 各組小鼠血清ADH和CYP2E1活性(U/ml，±s）比較

表2 各組小鼠血清ADH和CYP2E1活性(U/ml，±s）比較

與對照組比，①P＜0.05；②P＜0.01

數(shù)量 ADH CYP2E1急性肝炎 811.2±1.612.2±1.8①治療組 811.5±1.28.1±1.5對照組 812.5±1.27.9±1.4慢性肝炎 85.8±1.4① 11.8±1.7②小劑量PTX 86.9±2.6② 10.2±1.5大劑量PTX 84.6±1.77.8±1.5①對照組 84.3±0.66.5±1.2

2.2 肝組織 ADH、CYP2E1和 PPAR-α mRNA水平變化 急性和慢性酒精性肝炎小鼠肝組織ADH

圖2 慢性酒精性肝炎小鼠肝組織ADH、CYP2E1和PPAR-αmRNA水平

2.3 肝組織CYP2E1和PPAR-α蛋白表達(dá)變化 采用Image-Pro Plus6.0圖像處理軟件計(jì)算陽性細(xì)胞表達(dá)量，結(jié)果在急性和慢性酒精性肝炎動物肝組織CYP2E1陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)比對照組明顯增多[分別為（765±21）對（308±12）和（682±25）對（305±18），P<0.01]，而大劑量治療組分別為（521±18）和（418±12），顯著低于模型組（P<0.01）；急性和慢性酒精性肝炎動物肝組織PPAR-α陽性細(xì)胞表達(dá)比對照組明顯減少[分別為（322±15）對（721±18）和（262±23）對（689±14），P<0.01]，而大劑量治療組分別為（548±20）和（725±19），顯著高于模型組（P<0.01，圖3、4、5和 6）。

圖3 急性肝損傷小鼠肝組織CYP2E1蛋白表達(dá) 陽性細(xì)胞主要位于胞漿，分別呈彌漫或散在分布（SP，40×）A：模型組；B：治療組；D：對照組

圖4 急性肝損傷小鼠肝組織PPAR-α蛋白表達(dá) 陽性細(xì)胞主要位于胞核，分別呈彌漫或散在分布(SP，40×）A：模型組；B：治療組；D：對照組

圖5 慢性酒精性肝炎小鼠肝組織CYP2E1蛋白表達(dá) 陽性細(xì)胞主要位于胞漿，分別呈彌漫或散在分布(SP，40×）A：模型組；B：小劑量治療組；C：大劑量治療組；D：對照組

圖6 慢性酒精性肝炎小鼠肝組織PPAR-α蛋白表達(dá) 陽性細(xì)胞主要位于胞核，分別呈彌漫或散在分布(SP，40×）A：模型組；B：小劑量治療組；C：大劑量治療組；D：對照組

3 討論

PTX為甲基黃嘌呤化合物，是一種磷酸二酯酶抑制劑[8]，可提高細(xì)胞內(nèi)c-AMP水平。因改善血流變、擴(kuò)血管、改善細(xì)胞缺氧、抗炎、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫等作用[9]，已被證實(shí)能預(yù)防和改善肝纖維化、肺纖維化、脂肪肝、腦缺血。目前，關(guān)于PTX對ALD的作用已有報(bào)道，比如療效的觀察等[10～12]，研究表明，PTX確實(shí)可以改善ALD患者病情，但對其具體作用機(jī)理的研究尚未見報(bào)道。我們推測PTX改善ALD的機(jī)制可能與ADH無關(guān)。

國內(nèi)外大量研究已經(jīng)證實(shí)，CYP2E1的活化在ALD的發(fā)生發(fā)展中有著極其重要的作用[13]。

CYP2E1的活化是乙醇導(dǎo)致酒精性肝損傷和肝纖維化的原因[14]。Zanelli等證實(shí)，乙醇能夠延緩CYP2E1的降解[15]。MEOS是乙醇代謝的另一重要途徑，當(dāng)肝組織中乙醇濃度超過10 mmol/L時(shí)，MEOS被激活并對乙醇代謝起主要作用。乙醇在體內(nèi)代謝產(chǎn)生大量ROS，通過傳遞電子，氧化大分子物質(zhì)，引起肝細(xì)胞脫氧核糖核酸損傷、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化損傷[16]。實(shí)驗(yàn)中模型組CYP2E1 mRNA和蛋白水平均明顯增高，而治療組顯著降低，表明CYP2E1是ALD的一種損傷性蛋白。我們推測，PTX可能減少了乙醇代謝過程中ROS的產(chǎn)生。

PPAR是一類能被配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子[17]，目前已知有三種亞型，即α、β和γ，在各種組織中表達(dá)不同[18]。PPAR-α高表達(dá)于線粒體豐富和β氧化活性高的組織。PPAR-β高表達(dá)于脂肪組織，PPAR-γ幾乎均低表達(dá)于各種組織[19]。PPAR-α是近年來廣泛研究的調(diào)控脂肪酸轉(zhuǎn)化和氧化的核轉(zhuǎn)錄因子[20]，還可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)等。大量文獻(xiàn)證明PPAR-α缺失或降低會導(dǎo)致肝臟脂肪變和炎癥反應(yīng)。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，乙醛能夠抑制PPAR-α與其DNA和某些配體的結(jié)合能力。實(shí)驗(yàn)中乙醇暴露后，小鼠肝臟PPAR-α蛋白水平顯著降低，PTX治療增加了PPAR-α蛋白的表達(dá)水平，并且在長期乙醇暴露后PPAR-α mRNA水平也降低。這一結(jié)果表明，PPAR-α是ALD的一種保護(hù)性蛋白，且PTX改善ALD的作用與其對PPAR-α的活化有關(guān)。我們推測，PTX可能因其抗氧化作用減少了乙醛的生成量，并且削弱了酒精對PPAR-α及某些脂肪氧化酶表達(dá)的抑制，從而阻止了ALD的發(fā)生和發(fā)展。

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