別彩群，梁旭競(jìng)，湯紹輝，李 萌，孫士敏，范紅梅

肝癌是全球第五大常見(jiàn)的癌癥，占所有癌癥的5.6%。全球每年的新發(fā)病例約為 564，000例[1～3]，其中50%以上的肝癌發(fā)生在我國(guó)。肝癌惡性程度高，總體治療效果差，一般平均生存時(shí)間只有3個(gè)月左右。傳統(tǒng)的治療肝癌的手段包括外科手術(shù)治療、腫瘤局部治療、放射治療、化學(xué)抗腫瘤藥物治療以及綜合治療等。盡管治療方面有很多進(jìn)展，但總體的療效并不理想。因此，探索更有效的診斷和治療方法是目前肝癌研究亟待解決的重點(diǎn)課題之一。 肝癌的分子靶向治療研究有望成為治療肝癌的新手段，其中新型肝癌基因工程抗體作為載體的導(dǎo)向治療是未來(lái)肝癌免疫治療的研究熱點(diǎn)。本課題組在前期工作中已成功構(gòu)建了抗肝癌噬菌體scFv庫(kù)，并從中篩選出1株抗肝癌單鏈抗體，命名為 scFv4-16（GenBank登錄號(hào)：DQ640759），經(jīng)體外親和力成熟及初步鑒定，獲得了特異性較強(qiáng)、親和力較高的抗肝癌單鏈抗體scFvDM[4]。我們完成了對(duì)該抗體進(jìn)行人源化改造[5]，構(gòu)建和表達(dá)了單鏈抗體二聚體（又稱雙鏈或雙價(jià)抗體），并對(duì)其進(jìn)行了生物活性鑒定，獲得了一株免疫原性低、親和力高、穩(wěn)定性好、活性高的抗肝癌雙鏈抗體，被命名為BDM3[6]。納米顆粒是通過(guò)載藥微粒將治療藥物靶向?qū)虻讲≡畈课?，而?duì)非靶組織、器官、細(xì)胞影響很小，從而達(dá)到精確給藥的目的。在體外細(xì)胞試驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)BDM3及殼聚糖包封BDM3的免疫納米顆粒有抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用[7]。BDM3及BDM3免疫納米顆粒有望成為肝癌導(dǎo)向治療較理想的載體。99mTc具有半衰期短、能量低等良好的物理特性。本研究將進(jìn)行99mTc標(biāo)記抗體，觀察其在荷肝癌動(dòng)物體內(nèi)的靶向分布，及其對(duì)腫瘤的抑制作用，以探討放射免疫顯像診斷肝癌和靶向治療的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑和儀器 取4～6周齡雌性BALB/c-nu裸鼠30只，由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；肝癌細(xì)胞株 （Bel-7402、HepG2、SMMC-7721）為本實(shí)驗(yàn)室貯藏；抗肝癌雙鏈抗體及抗體納米顆粒均為本實(shí)驗(yàn)室制備，等電點(diǎn)為5.9；殼聚糖（脫已酰度>85%，黏度=2500 cps）為濟(jì)南海得貝生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；殼聚糖使用前用Co60γ-輻射（25 kGy劑量）滅菌；DMEM（Dulbecco's modified Eagle medium）細(xì)胞培養(yǎng)基干粉為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品，亞甲基二磷酸鹽（MDP）、二氯化錫（SnCl2-H2O）及新鮮淋洗液99mTc為本院核醫(yī)學(xué)科提供；使用美國(guó)CAPINTEC公司GE Infinia-Hawkeye同位素分析儀。

1.2 抗肝癌雙鏈抗體及抗體納米顆粒的制備 按文獻(xiàn)

[8～10]方法進(jìn)行BDM3及BDM3納米顆粒制備。納米粒子具體制備方法如下：離子交聯(lián)法制備殼聚糖/抗體二聚體BDM3納米粒子，稱取殼聚糖6 mg，攪拌溶解于1%冰醋酸溶液6 ml中，配制得到殼聚糖溶液，將抗肝癌單鏈抗體二聚體BDM3分別配制成濃度為0.1、0.5、1 g/L的水溶液；分別取去離子水和不同濃度抗體二聚體溶液1 ml，加入殼聚糖溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH，用電磁攪拌器中速攪拌5 min；磁力攪拌下緩慢滴加1 ml TPP（0.1%）水溶液，繼續(xù)攪拌30 min，得到乳光液；4℃條件下，20000 r/m的轉(zhuǎn)速高速離心30 min；沉淀物用蒸餾水反復(fù)洗滌，冷凍干燥，得到的白色粉末即為殼聚糖納米粒子和殼聚糖/抗體二聚體BDM3納米粒子。

1.3 納米顆粒濃度、包封率及載藥量的測(cè)定 將負(fù)載了不同濃度的抗肝癌單鏈抗體二聚體BDM的納米粒子懸浮液用20000 r/m超速離心30 min，用BCA試劑盒測(cè)定上清液中游離的抗肝癌單鏈抗體二聚體BDM的量，納米粒子對(duì)抗肝癌單鏈抗體二聚體BDM的包封率和載藥量用以下公式計(jì)算：BDM的包封率=（投入BDM總量-游離BDM量）/投入BDM總量×100%；BDM的載藥量 =已包裹BDM總量/微球總量×100%

1.4 抗肝癌抗體及抗體納米顆粒的99mTc標(biāo)記 采用99mTc預(yù)亞錫標(biāo)記法[11]標(biāo)記，即取亞甲基二膦酸鈉凍干品 1支，內(nèi)含亞甲基二膦酸鈉 5 mg，二氯化錫 0.5 mg。加2 ml生理鹽水溶解。分別取 5 mg抗BDM3抗體及BDM3納米顆粒，加入上述亞甲基二膦酸鈉稀釋液40μl，99mTc新鮮淋洗液37MBq 0.2 ml，充分混合后，在室溫下放置5 min。采用同位素分析儀檢測(cè)BDM3及其納米顆粒的99mTc標(biāo)記率。

1.5 荷人肝癌裸鼠模型的建立 將30只 BALB/c-nu裸鼠隨機(jī)分為3組。分別將Bel-7402、HepG2和SMMC-7721細(xì)胞消化，按1∶1∶1混勻，用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成1×107/ml，取0.1 ml接種于裸鼠左上肢腋窩皮下，2 w后腫瘤長(zhǎng)至0.5～1 cm3時(shí)開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.699mTc標(biāo)記抗體及抗體納米顆粒在荷人肝癌裸鼠體內(nèi)的分布 將荷人肝癌裸鼠30只隨機(jī)分為A、B、C三組，每組10只。A組通過(guò)腹腔注射99mTc-生理鹽水，B組注射99mTc-BDM3，C組注射99mTc-BDM3納米顆粒。在注入上述99mTc標(biāo)記物后分別于1 h、4 h和8 h將裸鼠固定后置于SPECT儀下，窗寬20%，VPC6準(zhǔn)直器，矩陣128×128，采集計(jì)數(shù)為1×105。完成圖像采集后，分別處死各組裸鼠，取腫瘤、全血及肝臟、心臟、腎臟及腦，予濾紙吸干血液，分別稱質(zhì)量，測(cè)放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算瘤（T）/非瘤（NT）比值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)用SPSS15.0 for Windows軟件包進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 抗肝癌雙鏈抗體及抗體納米顆粒的制備情況 抗肝癌雙鏈抗體BDM3的等電點(diǎn)為5.9，濃度為1 g/L，BDM3納米顆粒的抗體包封率為53%，每毫克殼聚糖納米粒子含BDM3為75μg。

2.299mTc的測(cè)定情況 使用同位素分析儀檢測(cè)生理鹽水的99mTc標(biāo)記率為90%，抗肝癌雙鏈抗體BDM3的99mTc標(biāo)記率為91%，BDM3納米顆粒的99mTc標(biāo)記率為92%。

2.3 放射性顯像情況99mTc標(biāo)記的抗肝癌雙鏈抗體BDM3及抗體納米顆粒在荷人肝癌裸鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布見(jiàn)表1～表3。B組在注射99mTc-BDM3后1～8 h，裸鼠腫瘤組織中均可出現(xiàn)放射性濃聚，其中在4 h時(shí)放射性濃集明顯高于其他器官組織；C組在注射99mTc-BDM3納米顆粒后1～8 h，裸鼠腫瘤組織中均出現(xiàn)較高的放射性濃聚，在4 h時(shí)放射性濃集明顯高于其他器官組織；而A組在注射99mTc生理鹽水后1～8 h，任何器官均無(wú)特異性放射性濃聚。C組腫瘤 /血比值在4 h最高，達(dá)到（5.63±0.26），與其他時(shí)間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。B組和C組 20只裸鼠瘤區(qū)明確顯像，顯像率為100%，A組與B組T/NT比值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），A組與C組T/NT比值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），B組與C組T/NT比值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。4 h腫瘤顯像見(jiàn)圖1a和圖1b，血液本底及其他臟器檢查核素分布顯著降低，與體內(nèi)生物學(xué)分布測(cè)定結(jié)果一致。A組在4 h時(shí)腫瘤組織始終沒(méi)有特異性核素濃聚（圖1c）。

表1 荷肝癌裸鼠腹腔注入99mTc-BDM3后各臟器T/NT值（±s）變化

表1 荷肝癌裸鼠腹腔注入99mTc-BDM3后各臟器T/NT值（±s）變化

臟器 1h 4h 8h血1.63±0.173.82±0.240.48±0.21心1.42±0.153.70±0.311.02±0.17肝1.55±0.114.03±0.591.50±0.20腎1.12±0.032.43±0.121.09±0.04肺1.37±0.342.82±0.410.97±0.19

表2 荷肝癌裸鼠腹腔注入99mTc-BDM3納米顆粒后各臟器T/NT值（±s）變化

表2 荷肝癌裸鼠腹腔注入99mTc-BDM3納米顆粒后各臟器T/NT值（±s）變化

臟器 1h 4h 8h血3.63±0.215.63±0.261.41±0.32心3.12±0.154.70±0.311.02±0.17肝3.55±0.114.03±0.591.50±0.20腎3.12±0.035.43±0.121.09±0.04肺3.37±0.345.82±0.410.97±0.19

表3 荷肝癌裸鼠腹腔注入99mTc–生理鹽水后各臟器T/NT值（±s）變化

表3 荷肝癌裸鼠腹腔注入99mTc–生理鹽水后各臟器T/NT值（±s）變化

臟器 1h 4h 8h血0.61±0.211.03±0.260.41±0.32心0.12±0.150.70±0.310.32±0.01肝0.51±0.121.13±0.190.50±0.10腎0.13±0.051.12±0.110.29±0.03肺0.37±0.040.82±0.310.27±0.19

圖1 三組動(dòng)物在腹腔注射99mTc后4 h顯像情況

3 討論

近年來(lái)，抗腫瘤抗體靶向治療受到密切關(guān)注，用單克隆抗體及單鏈抗體進(jìn)行放射免疫顯像對(duì)腫瘤進(jìn)行早期診斷及治療在國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有很多報(bào)道[12～15]。但由于完整的抗體分子量大，不容易穿透組織到達(dá)腫瘤部位，或在腫瘤組織中清除緩慢，不易到達(dá)靶組織，特別是由于單克隆抗體為鼠源性抗體，可誘發(fā)人抗鼠抗體（human anti-mouse antibody，HAMA）反應(yīng)，而由于單鏈抗體分子量太小，只有完整抗體的1/6，存在親和力弱、穩(wěn)定性差和體內(nèi)清除過(guò)快等不足，使其在人體內(nèi)的應(yīng)用受到不同程度的限制。

本實(shí)驗(yàn)室所制備的雙鏈抗體為二價(jià)抗體，克服了單克隆及單鏈抗體的不足，具有親和力好、免疫原性低、穩(wěn)定性好、活性高等優(yōu)點(diǎn)，適合腫瘤的放免顯像和靶向治療[3]。而納米載藥系統(tǒng)具有超微小體積，可通過(guò)人體最小的毛細(xì)血管，不易被吞噬細(xì)胞迅速清除，延長(zhǎng)了在循環(huán)系統(tǒng)中的存留時(shí)間和藥物的半衰期，可維持有效的血藥濃度，減少給藥次數(shù)，提高療效；能夠穿透組織間隙并被細(xì)胞吸收，改變生物膜運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制，增加藥物對(duì)膜的透過(guò)性，有利于吸收和細(xì)胞內(nèi)藥效的發(fā)揮；由于載藥納米粒子的粘附性以及小的粒徑，既有利于局部用藥時(shí)滯留性的增加，也有利于提高藥物與腸壁的接觸時(shí)間和接觸面積，提高生物利用度[16～18]，目前也被廣泛用于靶向治療。本研究的主要目的在于分析抗肝癌雙鏈抗體BDM3及其納米顆粒在荷肝癌裸鼠體內(nèi)的靶腫瘤分布特性，從而為肝癌早期診斷及治療提供一個(gè)新的途徑。

本研究經(jīng)腹腔分別注射99mTc-生理鹽水、99mT c-BDM3和99mT c-BDM3納米顆粒至荷肝癌裸鼠，觀察 1 h、4 h和8 h腫瘤顯像。在注射99mTc-BDM3和99mTc-BDM3納米顆粒后1～8 h，裸鼠腫瘤組織中均可出現(xiàn)放射性濃聚，其中在4 h時(shí)裸鼠腫瘤組織中的放射性分布明顯高于其他器官組織，而對(duì)照組在注射99mTc-生理鹽水后1～8 h均無(wú)特異性放射性濃聚。注射99mTc-BDM3和99mT c-BDM3納米顆粒裸鼠的顯像率為100%。

本研究結(jié)果顯示，同位素標(biāo)記的雙鏈抗體及雙鏈抗體納米顆粒均能很好地在腫瘤組織中濃聚，而在非腫瘤組織中無(wú)濃聚現(xiàn)象，原因考慮為該抗體為抗肝癌特異性抗體，具有明確靶向性，而抗體納米顆粒注射組濃聚現(xiàn)象較抗體組更顯著，考慮為抗體納米顆粒具有雙重靶向作用，能更好地聚集在腫瘤組織，增加顯像效果。該結(jié)果符合我們目前腫瘤治療的策略，既可最大限度地發(fā)揮抗腫瘤作用，同時(shí)又最大限度地減少對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用。故本實(shí)驗(yàn)室制備的抗肝癌雙鏈抗體及其納米顆粒對(duì)肝癌組織具有很好的親和力，可望作為肝癌診斷和治療的靶向載體。

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