王 晶 武書庚 張海軍 岳洪源 齊廣海

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放試驗(yàn)室，北京 100081)

蛋雞的魚(yú)腥味綜合征(fish odour syndrome)系由含黃素單氧化酶3(flavin-contain monenzyme，F(xiàn)MO3)基因突變導(dǎo)致雞體無(wú)法正常代謝三甲胺(trimethylamine，TMA)，從而沉積于卵泡中，形成魚(yú)腥味雞蛋。近年來(lái)，消費(fèi)者對(duì)畜禽產(chǎn)品安全性、營(yíng)養(yǎng)保健性、風(fēng)味等要求不斷提高，其中，魚(yú)腥味嚴(yán)重影響了雞蛋的風(fēng)味和可接受性。通過(guò)標(biāo)記輔助選擇可以剔除群體中易感基因型個(gè)體，減少魚(yú)腥味雞蛋的檢出率，提高雞蛋品質(zhì)。因此，需要了解突變基因型個(gè)體在雞群中的分布及基因型對(duì)雞蛋風(fēng)味的影響。1932年，Vondell首次報(bào)道了魚(yú)腥味雞蛋;1973年，確定TMA是引起雞蛋魚(yú)腥味的主要物質(zhì)，95%存于蛋黃中［1］。TMA生成的前體物質(zhì)有芥子堿、膽堿、氧化三甲胺等，當(dāng)飼糧中添加菜籽及其加工物、魚(yú)粉或膽堿時(shí)極易誘發(fā)魚(yú)腥味蛋的產(chǎn)生［2-5］。正常情況下，體內(nèi)產(chǎn)生的TMA在肝臟FMO3催化下，生成無(wú)味的氧化三甲胺，隨尿液代謝出體外。通過(guò)雞FMO3基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)位于編碼區(qū)第984個(gè)堿基位置的突變［由腺嘌呤(A)突變成胸腺嘧啶(T)］與蛋雞魚(yú)腥味綜合征顯著相關(guān)，該位點(diǎn)引起FMO3第329個(gè)氨基酸由蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸，導(dǎo)致FMO3功能異常［6］。在人和牛上的研究也表明，F(xiàn)MO3基因突變能夠引起魚(yú)腥味綜合征［7-8］。針對(duì)T329S位點(diǎn)的變化，可將蛋雞個(gè)體分為AA(野生型)、AT(雜合型)和TT(突變型)基因型。FMO3基因位于雞的8號(hào)染色體末端，所在區(qū)域包括多個(gè)與經(jīng)濟(jì)性狀有關(guān)的基因和數(shù)量遺傳位點(diǎn)［9］。相關(guān)研究多集中于基因型、前體物質(zhì)水平對(duì)雞蛋TMA含量的影響上，然而關(guān)于基因型頻率分布、基因型對(duì)蛋品質(zhì)的影響等方面報(bào)道較少。本試驗(yàn)旨在檢測(cè)FMO3 T329S突變位點(diǎn)在我國(guó)商品代海蘭褐殼蛋雞群體中的分布，觀察基因型對(duì)蛋品質(zhì)和雞蛋TMA含量的影響，為雞蛋魚(yú)腥味的研究積累基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 海蘭褐產(chǎn)蛋雞FMO3基因型頻率分布

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所留民營(yíng)蛋雞試驗(yàn)基地隨機(jī)選擇150日齡海蘭褐蛋雞800只作為試驗(yàn)雞。

1.1.2 基因組DNA提取及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)反應(yīng)體系及程序

每只雞翅下靜脈采血，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，用血液基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN，DP318)提取 DNA。根據(jù) GenBank上雞FMO3的基因序列(GI:AJ431390)，針對(duì) T329S位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，引物序列為:上游5＇-ATGAGGCTATCTGTTCCCAAAG-3＇，下 游 5＇-GACCAATCCAATGACTGCCA-3＇，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為397 bp。

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為 10 μL:dd H2O 8 μL，10 μmol/L上下游引物各 0.1 μL，10 × Taq PCR Mix 1 μL，DNA 模板 0.3 μL，DreamTaq(5 U/μL)0.06 μL，dNTP(2.5 mmol/L)0.5 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 5 min;94℃ 30 s，66.1℃ 30 s，72℃30 s，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min;4℃保溫。

1.1.3 酶切反應(yīng)體系及程序

采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析方法(PCR-RFLP)檢測(cè)個(gè)體基因型，限制性內(nèi)切酶為BsrⅠ，該內(nèi)切酶所切序列為:5＇-ACTGGN↓-3＇，3＇-TGAC↑CN-5＇。其中箭頭所指位置為酶切位點(diǎn)，酶切溫度65℃，時(shí)間4 h。酶切體系20 μL:PCR 產(chǎn)物 10 μL，dd H2O 7 μL，10 × Buffer 2 μL，BrsⅠ酶 1 μL。酶切完成后，2% 的瓊脂糖凝膠(含0.3%Golden View)電泳檢測(cè)，EDAS290凝膠成像(Kodak公司)系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2 FMO3基因型對(duì)蛋品質(zhì)和雞蛋TMA含量的影響

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

46周齡時(shí)，選用已確定FMO3基因型海蘭褐產(chǎn)蛋雞120只，分為3個(gè)組，其中AT基因型、TT基因型各54只，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)9只;AA基因型12只，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2只。預(yù)試期1周，試驗(yàn)期6周。

1.2.2 試驗(yàn)飼糧和飼養(yǎng)管理

參照《雞的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)，配制玉米-豆粕型試驗(yàn)飼糧(表1)。所有參試蛋雞采用相同的常規(guī)飼養(yǎng)管理。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutrient levels of the experimental diet %

1.2.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

蛋品質(zhì)測(cè)定:于試驗(yàn)第40～42天，每重復(fù)收集6枚雞蛋(AA基因型收集4枚)，4℃保存。蛋黃顏色、蛋白高度、哈夫單位采用雞蛋品質(zhì)測(cè)定儀(以色列ORKA Food Technology Ltd.)測(cè)定;蛋殼厚度用蛋殼厚度測(cè)量計(jì)(ESTG-1，以色列ORKA Food Technology Ltd.)測(cè)定;蛋殼強(qiáng)度用蛋殼強(qiáng)度分析儀(Egg Force Reader，以色列 ORKA Food Technology Ltd.)測(cè)定。

雞蛋 TMA 測(cè)定:試驗(yàn)第7、14、21、28、35 和42天，每重復(fù)取3枚蛋，分離蛋黃，混勻，取50 mL于-20℃保存，記錄蛋重和蛋黃重。采用苦味酸比色法［10］測(cè)定蛋黃TMA含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

海蘭褐產(chǎn)蛋雞FMO3基因型頻率分布:根據(jù)PCR-RFLP檢測(cè)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)不同基因型個(gè)體數(shù)量，計(jì)算群體基因頻率和基因型頻率，采用SPSS 16.0中的卡方檢驗(yàn)進(jìn)行哈代-溫伯格(Hardy-Weinberg)平衡性檢測(cè)。

FMO3基因型對(duì)產(chǎn)蛋雞蛋品質(zhì)影響:采用SPSS 16.0軟件的one-way ANOVA程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Duncan氏法進(jìn)行多重比較，以P＜0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 海蘭褐產(chǎn)蛋雞FMO3基因型頻率分布

2.1.1 PCR-RFLP分析

根據(jù)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出的條帶特異性較好，大小與理論值一致。酶切結(jié)果(圖1)表明，TT基因型為1條帶，397 bp;AA基因型為2條帶，267和130 bp;AT基因型為3條帶，分別為397、267和130 bp。

圖1 FMO3基因突變位點(diǎn)的PCR-RFLP檢測(cè)Fig.1 PCR-RFLP detect of mutation in FMO3 gene

2.1.2 序列分析

對(duì)FMO3基因在海蘭褐蛋雞血液DNA中的擴(kuò)增片段突變情況進(jìn)行分析，將AA、AT和TT基因型個(gè)體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2中黑框標(biāo)明變異位點(diǎn)。通過(guò)測(cè)序檢驗(yàn)，表明采用PCR-RFLP檢測(cè)能準(zhǔn)確地針對(duì)T329S位點(diǎn)分離篩選FMO3基因型。

圖2 FMO3基因序列對(duì)比Fig.2 Sequence comparison of FMO3 gene

2.1.3 基因型頻率及等位基因頻率分析

根據(jù)PCR-RFLP檢測(cè)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)海蘭褐殼蛋雞群體內(nèi)FMO3基因型頻率及等位基因頻率(表2，有效數(shù)據(jù)731只)。在海蘭褐蛋雞品系內(nèi)，對(duì)該位點(diǎn)而言，AT和TT基因型頻率明顯地高于AA基因型，T等位基因頻率高于A等位基因。用卡方檢驗(yàn)對(duì)FMO3基因型分布進(jìn)行服從Hardy-Weinberg平衡的檢驗(yàn)，表明該基因在海蘭褐蛋雞品系內(nèi)極顯著偏離了Hardy-Weinberg平衡(P＜0.001，表 3)。

表2 海蘭褐殼蛋雞FMO3基因型頻率及等位基因頻率Table 2 Frequencies of genotype and allele of FMO3 gene of Hy-Line brown laying hens

表3 FMO3基因T329S位點(diǎn)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)Table 3 Hardy-Weinberg equilibrium test for T329S site of FMO3 gene

2.2 FMO3基因型對(duì)蛋品質(zhì)和雞蛋TMA含量的影響

由表4可知，F(xiàn)MO3基因型對(duì)雞蛋常規(guī)品質(zhì)無(wú)顯著影響(P＞0.05)。由表5可知，F(xiàn)MO3基因型顯著影響了蛋黃TMA含量(P＜0.05)。試驗(yàn)第7天，TT基因型蛋黃中TMA含量顯著高于AA基因型(P＜0.05)，而與AT基因型無(wú)顯著差異(P＞0.05);試驗(yàn)第35和42天，TT基因型蛋黃中TMA含量顯著高于AA和AT基因型(P＜0.05)。

表4 FMO3基因型對(duì)蛋雞蛋品質(zhì)的影響Table 4 Effects of FMO3 genotype on egg quality of laying hens

表5 FMO3基因型對(duì)蛋黃三甲胺含量的影響Table 5 Effects of FMO3 genotype on TMA content in egg yolks μg/g

3 討論

3.1 海蘭褐產(chǎn)蛋雞FMO3基因型頻率分布

雞蛋的魚(yú)腥味問(wèn)題一直困擾著蛋雞生產(chǎn)者和學(xué)者。20世紀(jì)70年代，有學(xué)者提出雞的常染色體半顯性基因突變引起FMO3活性降低是導(dǎo)致產(chǎn)生腥味蛋的遺傳因素［11-12］。研究證實(shí)，F(xiàn)MO3是體內(nèi)TMA代謝的唯一有效酶［13］。因遺傳背景及選育程度等因素影響，T329S突變位點(diǎn)在各雞種中的分布不同。伊莎褐蛋雞群體中，TT基因型頻率約 15%［6，14］;羅曼褐蛋雞經(jīng)剔除突變位點(diǎn)后，突變基因型頻率已從 14.44%［6］降到了1.00%［14］。我國(guó)地方雞種中，絲羽烏骨雞TT基因型頻率高達(dá)60.40%［15］，太 湖 雞 為 20.40%，北 京 油 雞 為14.60%［16］。本試驗(yàn)中，海蘭褐蛋雞TT基因型個(gè)體數(shù)占群體20.0%，與Ward［14］的檢測(cè)結(jié)果相似(檢測(cè)個(gè)體數(shù) 598只，AA 1%，AT 79%，TT 20%)。張龍超［15］所測(cè)父母代海蘭褐母系(檢測(cè)個(gè)體數(shù)79只)FMO3基因型頻率分別為68.4%(AA)、17.7%(AT)、13.9%(TT)。二者結(jié)果都顯示該位點(diǎn)在海蘭褐蛋雞群體中均處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)。由于試驗(yàn)選用的為商品代蛋雞，對(duì)該品系的培育和對(duì)經(jīng)濟(jì)性狀的人為選擇可能是造成FMO3基因型分布不平衡的主要原因。

3.2 FMO3基因型對(duì)蛋品質(zhì)和雞蛋TMA含量的影響

FMO3基因型對(duì)雞蛋常規(guī)品質(zhì)的影響報(bào)道較少。本試驗(yàn)結(jié)果表明，基因型對(duì)蛋品質(zhì)無(wú)顯著影響。此外，基因型間蛋黃比例、含水量、粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量都無(wú)顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示)。因此選育過(guò)程中，可忽略對(duì)雞蛋上述品質(zhì)的影響。

雞蛋中TMA含量受遺傳因素和營(yíng)養(yǎng)因素的共同作用。T329S突變導(dǎo)致FMO3酶活性的下降是造成TT基因型個(gè)體代謝TMA異常的遺傳因素［10］。FMO3基因型對(duì)蛋黃TMA含量的影響主要表現(xiàn)為高劑量前體物存在時(shí)，TT和AT基因型蛋雞蛋黃TMA含量顯著升高。而常規(guī)水平添加氯化膽堿(0～2 200 mg/kg)可被雞體充分吸收，導(dǎo)致無(wú)足夠的膽堿進(jìn)入盲腸用于TMA的生成，不會(huì)誘發(fā)突變個(gè)體的魚(yú)腥味綜合征［2，5，17］。本試驗(yàn)中，受飼糧前體物劑量所限，雞蛋TMA含量低于嗅覺(jué)閾值，雖未表現(xiàn)出魚(yú)腥味，但可見(jiàn)TT基因型蛋雞TMA代謝的異常，提示生產(chǎn)中需注意TT基因型個(gè)體對(duì)雞蛋風(fēng)味的潛在危害。

感官可探測(cè)全蛋中TMA的最低含量約為1 μg/g［18］，蛋黃中為 3.79 μg/g［19］。消費(fèi)者可以接受蛋黃中TMA含量略高于感官檢測(cè)基準(zhǔn)點(diǎn)的雞蛋［5］。本試驗(yàn)中，TT基因型蛋雞雞蛋TMA含量在第7、35和42天時(shí)顯著高于AA基因型，最大值為3.58 μg/g，均低于人們的嗅覺(jué)閾值，在可接受性范圍內(nèi)。

4 結(jié)論

商品代海蘭褐殼產(chǎn)蛋雞群體中(n=731)，AA、AT和TT基因型頻率分別為3.4%、76.6%和20.0%，偏離了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。飼糧中常規(guī)水平添加氯化膽堿，可見(jiàn)TT基因型蛋雞TMA代謝異常，但不會(huì)誘發(fā)產(chǎn)生魚(yú)腥味雞蛋。

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