任 曼 霍應(yīng)峰 楊鳳娟 劉 靈 羅艷紅 譙仕彥*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100193;2.北京同力興科農(nóng)業(yè)科技有限公司，北京 100193)

哺乳動(dòng)物腸道不僅是機(jī)體消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的首要部位，還扮演著阻擋有害抗原和病原菌入侵的首要屏障［1］。腸道形態(tài)、黏液合成能力(杯狀細(xì)胞數(shù)目)、上皮滲透性、刷狀緣酶活力等均可反映腸道黏膜的完整性，其中使用最多也最直接的評(píng)價(jià)腸道黏膜完整性的指標(biāo)是絨毛高度、隱窩深度、杯狀細(xì)胞數(shù)目和淋巴細(xì)胞數(shù)目。另外，分泌型免疫球蛋白A(sIgA)和內(nèi)源防御素的表達(dá)直接反映了腸道先天性免疫能力［2］。新生仔豬主要通過(guò)從攝取的母乳中獲得免疫球蛋白等免疫蛋白和調(diào)節(jié)因子，仔豬斷奶后腸道的結(jié)構(gòu)和功能都會(huì)發(fā)生顯著變化［3］，影響仔豬的生長(zhǎng)，每年“早期斷奶應(yīng)激綜合征”給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失［4］。近些年研究發(fā)現(xiàn)，斷奶會(huì)影響腸道先天免疫功能相關(guān)蛋白的表達(dá)，如人斷奶后腸道內(nèi)抗菌肽血管生成素4(ANG4)的表達(dá)是斷奶前的20倍［5］。有關(guān)仔豬斷奶前后腸道結(jié)構(gòu)變化的報(bào)道很多，但鮮見(jiàn)系統(tǒng)地研究斷奶對(duì)仔豬腸道先天免疫功能的研究。隨著內(nèi)源抗菌肽的研究，前人在豬體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了多種抗菌肽，但尚未發(fā)現(xiàn)與人ANG4同源的抗菌肽基因，在腸道內(nèi)表達(dá)較多的是豬防御素1(porcin β-defensin 1，pBD-1)和豬防御素 2(porcin β-defensin-2，pBD-2)［6］，它們與 sIgA 一起形成腸黏膜先天免疫屏障，抵御病原微生物的入侵［7］。因此，本文以不同日齡仔豬腸道黏膜形態(tài)及sIgA濃度和防御素基因表達(dá)的變化為切入點(diǎn)，旨在研究斷奶對(duì)仔豬腸道屏障功能的影響，特別是完整性、免疫球蛋白和防御素有無(wú)變化，為斷奶仔豬腸道屏障功能發(fā)育規(guī)律的進(jìn)一步研究和預(yù)防調(diào)控仔豬斷奶應(yīng)激提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和飼糧

試驗(yàn)選用6窩杜×長(zhǎng)×大健康仔豬，每窩挑選出生狀況良好仔豬各4頭。仔豬試驗(yàn)期由各自母豬喂養(yǎng)，無(wú)教槽料適應(yīng)，產(chǎn)房統(tǒng)一安裝保溫箱及保溫墊，混凝土產(chǎn)床，室內(nèi)平均溫度(27±2)℃，濕度35% ～55%。試驗(yàn)期間，每日對(duì)產(chǎn)房地面，產(chǎn)床進(jìn)行消毒。斷奶前仔豬采食母乳，21 d斷奶后仔豬在產(chǎn)床待1周后轉(zhuǎn)入保育舍，飼喂商業(yè)保育顆粒飼料，自由采食。試驗(yàn)期間仔豬自由飲水。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和樣品采集

本試驗(yàn)于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)涿州動(dòng)物試驗(yàn)基地進(jìn)行。于出生7、14和21 d以及斷奶后14 d(出生35 d)分別從6窩仔豬中每窩挑選1頭健康仔豬(共24頭)，每個(gè)時(shí)間處理6頭仔豬，屠宰后剖開(kāi)腹腔，去除淋巴結(jié)后將小腸放平，取相同部位的空腸10 cm，用無(wú)菌0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)(pH 7.4)沖洗后用干凈的濾紙小心擦干，用載玻片刮取空腸黏膜，放于1.5 mL離心管冷凍保存。另從十二指腸中部和空腸中部分別采集2段5 cm左右的腸斷，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗后一段放于4%多聚甲醛溶液(0.1 mol/L PBS，pH 7.0～7.6)中進(jìn)行固定，另一段放于液氮迅速冷凍，然后貯存于-80℃冰箱中。

1.3 腸道形態(tài)和腸上皮淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)

多聚甲醛溶液固定后的腸段經(jīng)石蠟包埋后切成5 μm切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，每個(gè)樣品做5張切片，每個(gè)切片選取6個(gè)典型視野，采用圖像分析軟件對(duì)處理采集的圖像并量取絨毛高度(絨毛頂端至隱窩開(kāi)口處)和隱窩深度(絨毛隱窩基底處至隱窩低端)，單位μm。每頭仔豬測(cè)定6個(gè)不同腸段的絨毛，從基部開(kāi)始計(jì)數(shù)，每100個(gè)柱狀細(xì)胞中杯狀細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)目。

1.4 空腸黏膜sIgA濃度的測(cè)定

向空腸黏膜中加入1 mL含2 mg/mL蛋白酶抑制劑(華興博創(chuàng)生物技術(shù)有限公司，北京)的0.01 mol/L PBS，用組織勻漿機(jī)(IKA Work，南京)勻漿黏膜組織，3 500 r/min離心15 min，收集上清。按照酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)定量測(cè)定試劑盒(Cusabio Biotech Company，武漢)的說(shuō)明，進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定黏膜sIgA濃度。

1.5 空腸組織中防御素基因mRNA的表達(dá)

切取1～2 cm空腸腸段在研缽中加入液氮研磨，取100 mg組織用于提取總RNA，提取方法參照RNAzol RT試劑盒(Molecular Research Center，Cincinnati，OH)說(shuō)明。用 Nanodrop ND-1000測(cè)定所提總RNA的質(zhì)量和濃度，當(dāng)OD260nm/OD280nm在1.8～2.0和 OD260nm/OD230nm在1.5～2.2說(shuō)明RNA質(zhì)量較好，可用于下一步試驗(yàn)。取1 μg RNA加入到20 μL反轉(zhuǎn)體系中，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，大連)說(shuō)明將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA。

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)提供的相關(guān)基因序列，使用Primer Premier 5.0生物軟件設(shè)計(jì)pBD-1、pBD-2以及內(nèi)參基因β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)的PCR特異引物(表1)，由三博生物有限公司合成(北京)。

表1 基因引物序列Table 1 Sequences of gene primers

首先制備實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，取普通PCR反應(yīng)產(chǎn)物1 μL用滅菌超純水稀釋100倍后，再逐級(jí)稀釋至109倍，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)?zāi)０逯械乃鶞y(cè)基因cDNA濃度，選擇8個(gè)連續(xù)的濃度梯度作為標(biāo)準(zhǔn)曲線模板與cDNA模板一起按照試劑盒(TaKaRa，大連)說(shuō)明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系如下:Buffer 5 μL，SYBR GreenⅡ0.2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各 0.4 μL，cDNA模板 1 μL，無(wú) RNA 酶超純水 3 μL，空白對(duì)照組以相同體積超純水代替cDNA模板。反應(yīng)于ABI 7500 RT-PCR儀器(Applied Biosystems)中進(jìn)行，反應(yīng)程序如下:95℃ 30 s;95℃ 5 s，退火溫度下34 s，42個(gè)循環(huán)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有測(cè)定結(jié)果均以平均值和SEM表示，顯著性統(tǒng)計(jì)采用SAS 8.1軟件中單因素方差(one-way ANOVA)分析進(jìn)行，差異顯著時(shí)采用Duncan氏法多重比較。當(dāng)P＜0.05為差異顯著，0.05＜P＜0.10為具有顯著性趨勢(shì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 仔豬腸道形態(tài)變化

為研究仔豬出生至斷奶后小腸形態(tài)變化，本試驗(yàn)測(cè)定了仔豬出生7、14、21和35 d的十二指腸和空腸絨毛高度和隱窩深度以及兩者之比(表2)。結(jié)果表明，與十二指腸相比，哺乳仔豬空腸具有更高的絨毛、更淺的隱窩和更大的絨毛高度/隱窩深度(V/C);斷奶后(出生35 d)，以上指標(biāo)全部逆轉(zhuǎn)，即空腸絨毛高度低于十二指腸，隱窩深度高于十二指腸，V/C也低于十二指腸。較出生7 d，出生14和21 d的十二指腸和空腸絨毛高度顯著降低(P＜0.05)、空腸的V/C變小，斷奶成為一個(gè)分界點(diǎn)，斷奶之后，十二指腸的絨毛高度與出生7 d無(wú)顯著差異(P＞0.05)，但顯著高于出生14和21 d(P＜0.05)，空腸絨毛高度與出生21 d無(wú)顯著差異(P＞0.05)。斷奶后空腸的隱窩深度增加，顯著高于出生7、14、21 d(P＜0.05)。另外，斷奶后空腸的 V/C顯著低于出生7、14、21 d(P＜0.05)。

表2 不同日齡仔豬腸道形態(tài)的變化Table 2 The changes of intestinal morphology in piglets at different ages

2.2 仔豬腸上皮杯狀細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)目變化

腸上皮杯狀細(xì)胞是分泌黏液主要細(xì)胞，而腸上皮淋巴細(xì)胞主要參與腸道免疫和炎癥反應(yīng)。本試驗(yàn)對(duì)以上2種細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)(表2)，發(fā)現(xiàn)斷奶前仔豬空腸上皮中杯狀細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)目明顯多于十二指腸，說(shuō)明空腸是小腸分泌和免疫的重要腸段。經(jīng)過(guò)斷奶刺激，十二指腸上皮的杯狀細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)目較斷奶前(出生7、14、21 d)顯著增多(P＜0.05)?？漳c上皮杯狀細(xì)胞數(shù)目斷奶后與斷奶前沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)，但是斷奶后其上皮淋巴細(xì)胞數(shù)目顯著高于斷奶前(P＜0.05)。

2.3 仔豬空腸黏膜sIgA濃度和防御素基因表達(dá)變化

腸道上皮的漿細(xì)胞能夠分泌大量的sIgA，它在抵抗外來(lái)抗原及毒素中發(fā)揮著重要的作用，是黏膜天然免疫的重要組成部分之一。本試驗(yàn)結(jié)果表明，斷奶前出生21 d空腸黏膜中sIgA濃度為42.88 mg/g，斷奶后為71.19 mg/g(表3)，說(shuō)明斷奶后仔豬空腸分泌了更多的sIgA(P=0.001)以保護(hù)腸黏膜。

表3 仔豬斷奶前后空腸黏膜組織中sIgA濃度和防御素基因表達(dá)變化Table 3 The changes of jejunal mucosa sIgA concentration and defensin gene expressions in piglets before and after weaning

關(guān)于仔豬空腸防御素基因的表達(dá)，β-actin、pBD-1和pBD-2基因擴(kuò)增片段長(zhǎng)度與其引物一致，而且條帶單一。以β-actin基因?yàn)閰⒄眨玫絧BD-1和pBD-2基因的相對(duì)表達(dá)量(表3)，可知斷奶后仔豬空腸pBD-1和pBD-2基因的表達(dá)分別是出生21 d的1.64和1.65倍(P＜0.05)。

3 討論

小腸是通過(guò)腸上皮絨毛和隱窩發(fā)揮吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和阻擋各種抗原的功能?；粲谰玫龋?］研究表明，與初生時(shí)期相比，出生3 d時(shí)仔豬腸道絨毛顯著變高，隱窩顯著加深。與其不同，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)從出生7 d到斷奶前，仔豬絨毛變短，隱窩有不變或變淺的趨勢(shì)，Cera等［9］獲得與本試驗(yàn)類似的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)哺乳期間出生3～21 d的仔豬絨毛高度逐漸變短，造成不同研究結(jié)果的差異原因可能是研究仔豬的日齡階段不同所致，出生后仔豬腸道仍在發(fā)育，初乳中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和抗原刺激了腸道絨毛的生長(zhǎng)，同時(shí)也對(duì)乳中物質(zhì)形成了抗原耐受性，但在之后的哺乳過(guò)程中，腸黏膜缺乏刺激，絨毛生長(zhǎng)停滯。斷奶應(yīng)激使得仔豬采食量下降和營(yíng)養(yǎng)缺乏，腸道的結(jié)構(gòu)和功能受損，主要表現(xiàn)為斷奶后5 d時(shí)腸道絨毛萎縮至斷奶前的1/2高度，同時(shí)隱窩增生［10-11］。本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，斷奶后空腸絨毛高度較出生7 d顯著降低，同時(shí)斷奶后空腸的隱窩增生明顯，隱窩深度較斷奶前出生21 d顯著增加。

小腸黏膜上皮淋巴細(xì)胞是位于腸絨毛上皮細(xì)胞間或細(xì)胞內(nèi)的一群淋巴細(xì)胞，其絕大多數(shù)為CD8+T細(xì)胞。上皮淋巴細(xì)胞能夠分泌干擾素-γ、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-2和IL-5等多種細(xì)胞因子;其還具有自然殺傷活性，能殺死和清除病原感染和受損的上皮細(xì)胞［12］。在正常健康生理狀況下，上皮淋巴細(xì)胞處于相對(duì)穩(wěn)定的水平，如本試驗(yàn)中出生7～21 d仔豬十二指腸和空腸上皮中的淋巴細(xì)胞數(shù)目無(wú)顯著變化。當(dāng)受到斷奶等刺激時(shí)，淋巴細(xì)胞從血液向腸道上皮中遷移［13］，起到修復(fù)腸黏膜損傷和清除病原菌等作用。本試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了上述內(nèi)容，斷奶后仔豬十二指腸和空腸上皮中的淋巴細(xì)胞數(shù)目較斷奶前顯著增加。

sIgA的主要功能是防止細(xì)菌附著于黏膜細(xì)胞，一直以來(lái)被認(rèn)為其參與抵抗病原微生物黏附并侵入到黏膜的第一道保護(hù)屏障［14］。有關(guān)斷奶對(duì)腸道黏膜sIgA分泌的影響研究較少，研究發(fā)現(xiàn)仔豬在出生時(shí)固有層中含有T和B淋巴細(xì)胞，但其數(shù)目在出生后4周才加倍，出生時(shí)腸道中的sIgA濃度很低，出生后3周，sIgA分泌量隨著其分泌細(xì)胞數(shù)目的增加而增加［15］。本研究也發(fā)現(xiàn)，出生35 d(斷奶后)仔豬空腸組織中的sIgA濃度顯著高于出生21 d時(shí)的仔豬。

防御素是一類內(nèi)源性抗菌肽(具有抑菌或殺菌的小分子多肽)，可通過(guò)趨化和調(diào)節(jié)免疫因子的表達(dá)進(jìn)而參與調(diào)節(jié)機(jī)體的天然免疫，其在腸道、呼吸道和皮膚等上皮中的功能已被證明［5］。防御素根據(jù)其二級(jí)結(jié)構(gòu)差異可分為α、β和γ 3類，在豬體內(nèi)目前只發(fā)現(xiàn)了α和β防御素［16］。有關(guān)內(nèi)源抗菌肽表達(dá)隨腸道發(fā)育的變化研究較少，近年研究發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)的一些抗菌肽，如ANG4和再生胰島衍生蛋白3γ(REG3γ)在斷奶后腸道內(nèi)表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于斷奶前［17］，而凱瑟琳類抗菌肽主要在新生兒腸道內(nèi)表達(dá)［18］。從本研究也發(fā)現(xiàn)斷奶影響仔豬腸道防御素的表達(dá)，斷奶后空腸pBD-1和pBD-2的表達(dá)量都顯著增加，可能是由于表達(dá)防御素的細(xì)胞數(shù)目增加，也可能是斷奶刺激使得微生物通過(guò)免疫屏障進(jìn)入固有層，然后通過(guò)Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)等通路刺激防御素的表達(dá)，其具體的機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

①斷奶前，仔豬健康狀況下腸道屏障完整，sIgA和防御素表達(dá)的水平相對(duì)較低。

②斷奶破壞了腸道完整性，使得腸道絨毛萎縮，隱窩增生，V/C降低，腸道上皮屏障受到損傷，大量的淋巴細(xì)胞趨化至腸道上皮中。

③斷奶后微生物入侵刺激了仔豬空腸sIgA和防御素的表達(dá)。

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