劉玉潔 劉軍花 許婷婷 毛勝勇

(南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，南京 210095)

在現(xiàn)代集約化養(yǎng)殖中，為追求最大經(jīng)濟效益，生產(chǎn)者常給牛羊飼喂高精料。由于過多精料不能在瘤胃及小腸內(nèi)完全消化，部分精料進入后腸，在后腸大量發(fā)酵，結(jié)果導(dǎo)致后腸內(nèi)pH大幅下降，同時產(chǎn)生大量內(nèi)毒素等異常代謝產(chǎn)物［1］。后腸中過量的內(nèi)毒素及低pH可引發(fā)腸炎，使腸黏膜結(jié)構(gòu)受損。腸炎可導(dǎo)致動物采食量下降，引發(fā)腹瀉等腸道疾病，最終給畜牧生產(chǎn)帶來較大的經(jīng)濟損失。因此，探索有助于在高精料條件下維持動物腸黏膜正常結(jié)構(gòu)和緩解腸炎的措施，對于保障動物腸道健康及生產(chǎn)性能的發(fā)揮具有重要理論價值與研究意義。

谷氨酰胺(glutamine，Gln)是血液循環(huán)和組織內(nèi)游離氨基酸池中含量最豐富的一種氨基酸，是腸黏膜主要的能量來源。研究顯示，谷氨酰胺可改善腸炎患者全身免疫功能和營養(yǎng)代謝狀態(tài)［2］;可減少三硝基苯磺酸誘導(dǎo)結(jié)腸炎的小鼠腸黏膜腫瘤壞死因子α(TNF-α)的產(chǎn)生和釋放［3］。在泌乳奶牛上的應(yīng)用效果表明，添加谷氨酰胺可增強宿主的免疫應(yīng)答［4-5］，顯示谷氨酰胺在奶牛生產(chǎn)中具有應(yīng)用前景，但其是否具有保護反芻動物腸道健康的作用，目前尚不清楚。本試驗擬利用飼喂高精料的奶山羊為模型動物，研究添加谷氨酰胺對其盲腸黏膜形態(tài)和炎癥因子mRNA表達的影響，以期闡明谷氨酰胺在保護后腸健康上的效果，為實際生產(chǎn)提供新策略。

1 材料與方法

試驗于2012年1月至2012年4月在南京農(nóng)業(yè)大學動物房進行。

1.1 試驗設(shè)計

選用12頭健康、體重［(41.5±0.8)kg］相近的2.5歲的經(jīng)產(chǎn)薩能奶山羊母羊，按常規(guī)手術(shù)方法安裝永久性瘤胃瘺管，統(tǒng)一驅(qū)蟲、單欄飼養(yǎng)。高精料基礎(chǔ)飼糧參考NRC(2004)標準配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1，精粗比為7∶3。飼喂量(干物質(zhì)基礎(chǔ))為1.3 kg/d。每日分2次(08:00和17:30)等量飼喂，自由飲水。

采用隨機區(qū)組設(shè)計將12頭健康奶山羊隨機分為對照組(n=6，飼喂高精料)和谷氨酰胺組(n=6，谷氨酰胺添加量為50 g/d)。試驗期28 d。

表1 高精料基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the high concentrate basal diet(air-dry basis) %

1.2 試驗材料

谷氨酰胺以過瘤胃谷氨酰胺形式添加，由浙江康德權(quán)科技有限公司生產(chǎn)。

主要儀器:pH計(HI 9125，意大利HANNA Instruments)、GC-14B氣相色譜儀(日本島津)、掃描電子顯微鏡(S-3000N，日本HITACHI)、透射電子顯微鏡(H-7650，日本日立)、微量分光光度計(NanoDrop 1000，美國 Thermo)、實時定量PCR儀(StepOnePlusTMReal-Time PCR System，美國Applied Biosystems)。

1.3 盲腸內(nèi)容物和黏膜采集

在試驗期結(jié)束后屠宰山羊，迅速采集盲腸內(nèi)容物和黏膜樣，內(nèi)容物pH用pH計迅速測定。內(nèi)容物與雙蒸水1:1稀釋后3 600 r/min下離心10 min，取離心后的上清液，經(jīng)常規(guī)處理后，-20℃凍存，備測揮發(fā)性脂肪酸、乳酸和內(nèi)毒素濃度。盲腸黏膜樣用冰磷酸緩沖液清洗干凈后，分成2等份。第1份用4%多聚甲醛固定，用于石蠟切片;第2份用2.5%戊二醛固定，用于掃描和透射電鏡觀察。盲腸粘膜樣于液氮保存，用于總RNA抽提。

1.4 測定指標

1.4.1 盲腸發(fā)酵參數(shù)

盲腸內(nèi)容物內(nèi)毒素和乳酸濃度的測定分別參照張瑞陽等［6］和龍黎明等［7］的試驗方法。盲腸內(nèi)容物揮發(fā)性脂肪酸濃度采用氣相色譜法測定，溫度條件為:柱溫110℃，氣化室溫度180℃，檢測室溫度180 ℃［8］。

1.4.2 盲腸黏膜形態(tài)

用4%多聚甲醛固定，洗滌、酒精梯度脫水、浸蠟、包埋、切片、貼片、脫蠟復(fù)水、蘇木精-伊紅染色、封固，在光鏡下觀察盲腸黏膜形態(tài)。

用冰磷酸緩沖液反復(fù)清洗樣品，2.5%的戊二醛固定后，磷酸鹽緩沖液清洗，采用乙醇脫水后，冷凍干燥儀干燥樣品，用離子濺射儀鍍膜，掃描電子顯微鏡進行觀察。透射電鏡試驗中的樣品前處理與掃描電鏡預(yù)處理一致，綴以1%的鋨酸固定，乙醇梯度脫水，用丙酮置換后，浸漬、包埋、聚合、后修塊使樣品表面積小于0.2 mm×0.2 mm，超薄切片，經(jīng)鈾染色與鉛染色清洗后，透射電子顯微鏡觀察盲腸黏膜形態(tài)。

1.4.3 炎癥因子mRNA表達量

盲腸黏膜的總RNA的提取參照Chomczynski等［9］的方法，采用微量分光光度計測定總RNA濃度和純度。反轉(zhuǎn)錄條件與引物參照文獻［10-11］，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20℃儲存?zhèn)溆?。采用實時定量PCR儀評估盲腸黏膜中TNF-α、干擾素γ(IFN-γ)、白細胞介素 1β(IL-1β)、白細胞介素 6(IL-6)和白細胞介素10(IL-10)mRNA的表達量，相對定量采用 2-△△Ct法。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0中獨立性t檢驗進行統(tǒng)計分析。顯著性水平置于P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 盲腸發(fā)酵參數(shù)及內(nèi)毒素濃度

由表2可見，高精料條件下，盲腸內(nèi)容物pH約為7.00，總揮發(fā)性脂肪酸濃度達101.70 mmol/L，內(nèi)毒素濃度達5.14 lg(EU/g)，添加谷氨酰胺對盲腸內(nèi)容物pH以及揮發(fā)性脂肪酸、乳酸及內(nèi)毒素濃度皆無顯著影響(P＞0.05)。

表2 谷氨酰胺對飼喂高精料奶山羊盲腸發(fā)酵參數(shù)及內(nèi)毒素濃度的影響Table 2 Effects of glutamine on cecal fermentation parameters and endotoxin concentration of dairy goats fed a high concentrate diet

2.2 盲腸黏膜形態(tài)

光學顯微鏡觀察可見，對照組的盲腸黏膜發(fā)生脫落(圖1-A)，而谷氨酰胺組的盲腸黏膜表面完整(圖1-B);掃描電鏡觀察可見，對照組盲腸黏膜出現(xiàn)大面積的損傷(圖1-C)，谷氨酰胺組盲腸黏膜無病理性的變化(圖1-D);透射電鏡觀察可見，對照組的橋粒清晰可見，但緊密連接密度降低(圖1-E)，谷氨酰胺組的橋粒和緊密連接結(jié)構(gòu)均完整，連接結(jié)構(gòu)致密(圖1-F)。

2.3 盲腸黏膜炎癥因子mRNA表達量

由表3可見，添加谷氨酰胺顯著降低了奶山羊盲腸黏膜中 TNF-α mRNA的表達量(P＜0.05)，但對盲腸黏膜 IFN-γ、IL-1β、IL-6 和 IL-10的mRNA表達量無顯著影響(P＞0.05)。

3 討論

盲腸是反芻動物除瘤胃外的另一主要發(fā)酵器官，除具有消化、吸收及分泌的功能外，作為消化道黏膜屏障的重要組成部分，盲腸黏膜結(jié)構(gòu)對維持機體正常生理功能起著重要作用。研究表明，后腸黏膜屏障可阻止腸腔內(nèi)的毒素和微生物等穿透黏膜進入循環(huán)系統(tǒng)［12］。在腸黏膜屏障中，腸黏膜上皮細胞及其細胞間的各種連接結(jié)構(gòu)是腸道抵御外環(huán)境中有害物質(zhì)或病原體入侵腸黏膜的關(guān)鍵，是維持腸黏膜屏障功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［13］，因此，維持腸黏膜結(jié)構(gòu)的完整對于維護腸屏障功能至關(guān)重要。相關(guān)報道顯示，當動物采食高精料時，后腸內(nèi)環(huán)境紊亂，腸黏膜損傷，其原因可能涉及后腸低pH及高濃度內(nèi)毒素等毒物因子［1］。本試驗中，對照組盲腸內(nèi)容物中內(nèi)毒素的濃度高達1×105EU/g，同時盲腸黏膜表面受損，緊密連接超微結(jié)構(gòu)受到破壞，結(jié)果說明，飼喂高精料可導(dǎo)致盲腸黏膜結(jié)構(gòu)受損，提示該條件下腸黏膜屏障可能受損。但由于本試驗未能采用尤斯室(Ussing Chamber)等儀器研究后腸黏膜的通透性的具體變化情況，因而黏膜屏障到底受到多大程度的損傷，尚不清楚。但本試驗結(jié)果顯示，高精料可導(dǎo)致奶山羊后腸發(fā)酵異常，后腸黏膜結(jié)構(gòu)受到破壞，該結(jié)果也與 Gressley等［1］的報道一致。

圖1 谷氨酰胺對飼喂高精料奶山羊盲腸黏膜形態(tài)的影響Fig.1 Effects of glutamine on cecal mucosal morphology of dairy goats fed a high concentrate diet

表3 谷氨酰胺對飼喂高精料奶山羊盲腸黏膜炎癥因子mRNA表達量的影響Table 3 Effects of glutamine on the mRNA expression levels of inflammatory cytokines of cecal mucosal of dairy goats fed a high concentrate diet

在人和單胃動物腸道營養(yǎng)上的研究表明，谷氨酰胺是腸黏膜細胞的重要能源物質(zhì)，可促進黏膜的生長、修復(fù)及完整性的維持［14］。本試驗結(jié)果表明，較對照組而言，添加外源性谷氨酰胺使緊密連接超微結(jié)構(gòu)受到保護，有助于維持腸表面正常的形態(tài)，結(jié)果表明，谷氨酰胺對盲腸黏膜結(jié)構(gòu)的完整性具有保護作用，該結(jié)果也與谷氨酰胺在人和單胃動物腸道營養(yǎng)中的研究報道基本一致，其具體機制可能涉及谷氨酰胺可維持腸黏膜緊密連接結(jié)構(gòu)和促進腸細胞的生長，從而保障了后腸黏膜的完整性的機制。

本試驗中，后腸黏膜表面發(fā)生脫落，緊密連接超微結(jié)構(gòu)受損，提示后腸黏膜可能局部受損，引發(fā)局部炎癥。同時，Emmanuel等［15］報道，低 pH 與高濃度內(nèi)毒素可導(dǎo)致結(jié)腸黏膜通透性增加，使內(nèi)毒素移位。移位的內(nèi)毒素可進一步刺激機體產(chǎn)生大量TNF-α和IL-1β等細胞因子，加劇黏膜炎癥。本試驗中，較對照組而言，盡管谷氨酰胺組與對照組盲腸內(nèi)容物pH與內(nèi)毒素濃度大致相當，但TNF-α mRNA表達量顯著降低，該結(jié)果說明，谷氨酰胺組中的較完整腸黏膜結(jié)構(gòu)可能部分阻止了腸腔內(nèi)毒素等毒物因子的移位，從而削弱了這些毒物引發(fā)的腸炎反應(yīng)。但本試驗發(fā)現(xiàn)，作者所檢測的5個炎癥因子中，添加谷氨酰胺僅降低了盲腸內(nèi) TNF-α 的 mRNA表達量，對盲腸內(nèi) IFN-γ、IL-1β、IL-6和IL-10的mRNA表達量無顯著影響。該結(jié)果說明，在飼喂高精料飼糧時，添加谷氨酰胺僅能在一定程度上保護腸黏膜結(jié)構(gòu)的完整，部分降低高精料引發(fā)的后腸炎癥。

4 結(jié)論

高精料條件下，添加谷氨酰胺可加強盲腸黏膜緊密連接，一定程度上緩解盲腸黏膜的炎癥反應(yīng)，有助于維持后腸黏膜屏障的正常功能。

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