秦貴信 孫澤威 龍國徽 王 濤 白明昧

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，長春 130118;2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春 130118;3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長春 130118)

對飼料原料中蛋白質(zhì)的生物學(xué)品質(zhì)特征的認(rèn)識和其營養(yǎng)價(jià)值的評價(jià)關(guān)系，到環(huán)境中營養(yǎng)素與動物生命過程互動關(guān)系及其規(guī)律的深入揭示，關(guān)系到畜禽飼糧蛋白質(zhì)源的優(yōu)選、加工工藝優(yōu)化和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的評定，還關(guān)系到動物蛋白質(zhì)營養(yǎng)需求數(shù)量、需求結(jié)構(gòu)的有效調(diào)控及動物生產(chǎn)力水平的充分發(fā)揮。所以，這方面的問題既是動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)與技術(shù)領(lǐng)域的一個(gè)關(guān)鍵的上游性和基礎(chǔ)性的理論創(chuàng)新問題，也是現(xiàn)代畜牧業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)發(fā)展的一個(gè)具有重要經(jīng)濟(jì)意義的實(shí)踐問題。在上百年的研究探索過程中，人們對評價(jià)方法不斷進(jìn)行改進(jìn)，但這些改進(jìn)大都沒有離開用實(shí)體動物消化試驗(yàn)，即用表觀消化率、真消化率、回腸末端消化率等這樣一些反映飼料蛋白質(zhì)在通過消化道過程中所發(fā)生的數(shù)量變化的指標(biāo)來評價(jià)飼料。用消化試驗(yàn)評價(jià)飼料存在諸多缺點(diǎn)和問題。在實(shí)踐上，消化試驗(yàn)成本高、時(shí)間長、誤差大(尤其是用差比法測定單一飼料養(yǎng)分消化率);在原理上，消化指標(biāo)只是把通過消化道的過程當(dāng)成了一個(gè)“黑匣子”，而沒有把蛋白質(zhì)消化吸收情況，即飼料蛋白質(zhì)在消化道內(nèi)其氨基酸和小肽釋放及吸收的時(shí)空情況反映出來。而這些情況與蛋白質(zhì)即氨基酸的代謝、氮素的沉積存在緊密的聯(lián)系。

在生產(chǎn)實(shí)踐中，常常會發(fā)現(xiàn)用不同飼料原料配制的營養(yǎng)水平(如可消化蛋白質(zhì)和氨基酸)相同的飼糧，其飼喂效果相差懸殊。蛋白質(zhì)含量、氨基酸組成相同的飼料，其營養(yǎng)價(jià)值利用率卻不同。同一種飼料的同一氨基酸，改變加工過程和貯藏過程，其利用率也會發(fā)生很大變化。這些情況說明在飼料營養(yǎng)價(jià)值評定的客觀性和準(zhǔn)確性方面仍有許多問題需要研究。近些年來，國內(nèi)外一些研究結(jié)果表明，飼料蛋白質(zhì)及氨基酸的利用效率與飼料的物理性質(zhì)和化學(xué)結(jié)構(gòu)，如溶解性、擴(kuò)散性、高級結(jié)構(gòu)(螺旋、折疊、無規(guī)則卷曲)、蛋白質(zhì)分子柔性(氫鍵、二硫鍵數(shù)量和位置)、氨基酸組成、抗?fàn)I養(yǎng)特性等理化特性存在十分密切的關(guān)系［1-3］。通過一些現(xiàn)代的測試手段，將飼料營養(yǎng)物質(zhì)的物理、化學(xué)及生物學(xué)特征測定或讀取出來，并將其與動物的生命過程(消化、吸收、代謝)關(guān)系做較全面的揭示，很可能會建立起更準(zhǔn)確客觀的飼料營養(yǎng)價(jià)值評價(jià)體系。

本文對國內(nèi)外有關(guān)的飼料原料蛋白質(zhì)物理、化學(xué)、生物學(xué)特性的評價(jià)方法及在飼料營養(yǎng)價(jià)值評定方面的應(yīng)用進(jìn)行了相關(guān)闡述。發(fā)現(xiàn)早期傳統(tǒng)蛋白質(zhì)營養(yǎng)理論，即僅僅以粗蛋白質(zhì)含量、氨基酸的種類和數(shù)量來評價(jià)飼料蛋白質(zhì)的質(zhì)量，可能還不夠充分。目前，關(guān)于飼料蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與其營養(yǎng)價(jià)值的關(guān)系研究相對較少，但已受到越來越多的關(guān)注，特就此作一簡要綜述。通過揭示以上幾種因素與蛋白質(zhì)消化及營養(yǎng)價(jià)值的關(guān)系，深入了解并正確認(rèn)識氮素狀態(tài)，才能完善氮素營養(yǎng)的理論體系以及建立精確科學(xué)的飼料評價(jià)體系，這不僅為飼料加工調(diào)制確立了科學(xué)精準(zhǔn)的目標(biāo)，而且為不同類別畜禽優(yōu)選飼料蛋白質(zhì)源和解決養(yǎng)殖業(yè)節(jié)氮減排、生態(tài)型養(yǎng)殖業(yè)技術(shù)體系提供了科學(xué)依據(jù)。

1 飼料蛋白質(zhì)物理特性的評價(jià)指標(biāo)、方法及其在飼料營養(yǎng)價(jià)值評定中的應(yīng)用

1.1 蛋白質(zhì)的溶解性

溶解性是指蛋白質(zhì)在水溶液或鹽溶液中溶解的性能。一般采用溶解度(PS)來衡量蛋白質(zhì)溶解性的大小。蛋白質(zhì)作為大分子有機(jī)化合物，在水中以分散態(tài)(膠體態(tài))存在，因此，蛋白質(zhì)在水中無嚴(yán)格意義上的溶解度，只是將蛋白質(zhì)在水中的分散量或分散水平相應(yīng)地稱為蛋白質(zhì)的溶解度。溶解度的測定方法主要有定氮法［4］和考馬斯亮藍(lán)法［5］，目前廣泛采用的是 Dale 等［4］提出的 0.2%KOH溶液定氮法，即將溶于0.2%KOH溶液中的蛋白質(zhì)占樣品總粗蛋白質(zhì)含量的百分比視為溶解度。

在蛋白質(zhì)的功能特性中，溶解度是最重要的一項(xiàng)指標(biāo)，對蛋白質(zhì)的乳化性、凝膠性及發(fā)泡性均有顯著影響［6-7］。Kinsella［8］提出蛋白質(zhì)在不同pH條件下的溶解度曲線是評價(jià)蛋白質(zhì)變性程度、控制蛋白質(zhì)加工工藝的第一指標(biāo)，并在豆粕、菜籽粕、花生粕、棉籽粕等加工處理控制與評價(jià)中得到了廣泛的應(yīng)用［3，9-11］。同時(shí)，國內(nèi)外學(xué)者針對菜籽、豆粕等蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)、溶解度、消化率的相關(guān)關(guān)系開展了大量的研究(圖1)，客觀、系統(tǒng)地揭示了蛋白質(zhì)溶解度與消化率間的相關(guān)關(guān)系。

圖1 不同蛋白質(zhì)源飼糧胃腸道游離氨基酸總量的變化規(guī)律Fig.1 The variation pattern of total free amino acids in the gastrointestinal tract from different proteins sources［12］

1.2 蛋白質(zhì)的分散性

蛋白質(zhì)的分散性是指在攪拌的情況下，蛋白質(zhì)在水中快速分散的能力。通常用蛋白質(zhì)分散性指標(biāo)(PDI)來評價(jià)。美國油脂化學(xué)家協(xié)會(AOCS)提出了經(jīng)典的測定方法［13］:PDI(%)=(水中分散性蛋白質(zhì)百分含量/樣品中總蛋白質(zhì)百分含量)×100。

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為PDI僅僅是蛋白質(zhì)溶解度的一種表示方法，將蛋白質(zhì)的溶解性與分散性視為相同指標(biāo)，而事實(shí)上在加工處理過程中很難得到同時(shí)擁有高分散性和高溶解性的蛋白質(zhì)產(chǎn)品，往往會出現(xiàn)高分散性的蛋白質(zhì)制品通常溶解性不夠理想，而高溶解性的通常分散性不夠理想［14］。

國外通常用PDI表示油料蛋白質(zhì)在加工過程中的受熱程度［15］。Qin 等［16］便采用 PDI來探討改善不同來源全脂大豆品質(zhì)的適宜加工條件，目前PDI已成為常用的蛋白質(zhì)性能指標(biāo)之一，是確定加工工藝條件的依據(jù)。

2 飼料蛋白質(zhì)化學(xué)特性的評價(jià)指標(biāo)、方法及其在飼料營養(yǎng)價(jià)值評定中的應(yīng)用

2.1 氨基酸組成

氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位，賦予蛋白質(zhì)特定的分子結(jié)構(gòu)形態(tài)，使其分子具有生化活性。魚粉、豆粕、花生粕、玉米蛋白粉、血粉和羽毛粉等不同飼料蛋白原料具有不同的氨基酸組成，如玉米蛋白粉中嚴(yán)重缺乏賴氨酸，羽毛粉富含半胱氨酸，在動物體的利用效率差異顯著。

目前蛋白質(zhì)氨基酸評定結(jié)果大多源于氨基酸分析儀，是采用強(qiáng)酸在高溫條件下水解蛋白質(zhì)后進(jìn)行的測定，而動物的消化酶則無法將飼料蛋白質(zhì)中的所有氨基酸釋放出來，進(jìn)而造成飼料蛋白質(zhì)的氨基酸組成與動物消化道實(shí)際利用氨基酸數(shù)量與組成不一致。不同飼料蛋白質(zhì)中氨基酸組成、排序及空間結(jié)構(gòu)上的差異，以及加工處理過程中造成的各種不同的特定結(jié)構(gòu)，是導(dǎo)致飼料氨基酸在動物胃腸道內(nèi)釋放規(guī)律不一致的主要因素(圖1)。深入認(rèn)識蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與其在動物體消化道酶解模式的關(guān)系，對于提高氮營養(yǎng)素利用效率具有重要意義。

2.2 蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)及柔性

2.2.1 概念、定義

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是指組成蛋白質(zhì)分子的原子在空間上的排布位置，氨基酸的序列中包含著分子結(jié)構(gòu)的信息，在與周圍環(huán)境的相互作用中表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)形狀的變化，是一種三維空間實(shí)體。丹麥生物化學(xué)家Kail Linderstram首先將蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)劃分為一級、二級和三級結(jié)構(gòu);英國化學(xué)家Bernal又使用四級結(jié)構(gòu)來定性描述具有復(fù)雜多肽鏈蛋白質(zhì)分子的亞基結(jié)構(gòu);后來，在二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)之間發(fā)現(xiàn)了超二級結(jié)構(gòu)(結(jié)構(gòu)模體)和結(jié)構(gòu)域，揭示出蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是具有豐富層次的體系。

蛋白質(zhì)的柔性是在穩(wěn)定構(gòu)象狀態(tài)下的蛋白質(zhì)組成中不斷動態(tài)變化的局部結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的柔性特征分析是理解蛋白質(zhì)動態(tài)行為表現(xiàn)的重要內(nèi)容，蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)是與功能緊密相連的柔性結(jié)構(gòu)。根據(jù) Anfinsen［17］的熱力學(xué)假定，在正常的生理環(huán)境(溶液、pH、離子強(qiáng)度、溫度或其他成分，如金屬離子、與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合的非氨基酸基團(tuán)的存在等)條件下，天然蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)是使整個(gè)系統(tǒng)的吉布斯自由能最低的結(jié)構(gòu)。Anfinsen［17］在假定中特別強(qiáng)調(diào)了在不同環(huán)境條件下有不同構(gòu)象的可能性，由于蛋白質(zhì)與環(huán)境相互作用產(chǎn)生構(gòu)象改變，生物活性總是要在不同程度上與蛋白質(zhì)天然構(gòu)象變化相聯(lián)系。蛋白質(zhì)分子與周圍環(huán)境具有互動性，它永遠(yuǎn)處于運(yùn)動狀態(tài)，蛋白質(zhì)各個(gè)氨基酸殘基的熱振動、肽鏈的熱力學(xué)運(yùn)動都屬于構(gòu)象變化。早在19世紀(jì)末，科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)酶與底物之間的相互作用具有高度的幾何互補(bǔ)性。隨后，F(xiàn)ischer［18］提出的“鎖 - 匙”模型，用“一把鑰匙配一把鎖”這種形象的模型來描述酶和底物之間的相互作用。盡管這種模型解釋了蛋白質(zhì)相互作用特異性，但對于蛋白質(zhì)的柔性以及變構(gòu)性質(zhì)卻無能為力。Koshland［19］在“鎖-匙”模型的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，建立了“誘導(dǎo)契合”模型，成功的將蛋白質(zhì)的柔性以及結(jié)合過程中的變構(gòu)特性考慮了進(jìn)來。他認(rèn)為酶與底物結(jié)合的時(shí)候，并不是剛性的結(jié)合，二者會相互誘導(dǎo)發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，最終形成正確的復(fù)合體結(jié)構(gòu)進(jìn)而完全催化的過程。因此，了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)柔性對于蛋白質(zhì)正常功能的發(fā)揮有著至關(guān)重要的意義。

2.2.2 測定指標(biāo)及方法

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中，不論是α-螺旋還是β-折疊組成的片層結(jié)構(gòu)中，都存在著較多的氫鍵致使規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)都有相當(dāng)?shù)膭傂浴Ｈ绻欢坞亩沃胁淮嬖跉滏I或其他的相互作用，則肽段中的各個(gè)殘基間有更大的自由度，表現(xiàn)出極大的柔性，這類肽段沒有規(guī)則性。加工后的蛋白質(zhì)具有部分二級結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，介乎前兩者之間，即“剛?cè)峒鎮(zhèn)洹?圖2)。

目前，常用的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)檢測方法有X射線晶體衍射法、核磁共振光譜法、圓二色光譜法、紫外光譜法、熒光光譜法、拉曼光譜法與紅外(FTIR)光譜法等。這些方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。其中FTIR光譜和拉曼光譜同屬分子振動光譜，是蛋白質(zhì)構(gòu)象研究工作中的重要工具。既適用于結(jié)晶質(zhì)物質(zhì)，也適用于非晶質(zhì)物質(zhì);既可以測定固體樣品，也可以測定液體樣品;可用于鑒別化合物中的化學(xué)鍵類型，可對分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行推測［21］。FTIR光譜對C—O、N—H和O—H等極性鍵伸縮振動靈敏，而拉曼光譜對C=C、C—C和S—S等非極性鍵靈敏，兩者可以相互補(bǔ)充提供分子結(jié)構(gòu)的線索［22］。計(jì)算機(jī)輔助解析方法的開發(fā)和應(yīng)用，如去卷積、二階導(dǎo)數(shù)和曲線擬合可定量分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)［23-24］。

2.2.3 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在飼料營養(yǎng)價(jià)值評定中的應(yīng)用

Yan 等［1］、Khan 等［2］、Peng 等［3］分別針對大麥、亞麻薺種子、玉米、燕麥、小麥、小扁豆、豌豆、菜籽粕、豆粕、血粉、肉粉等飼料中蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)、功能特性、消化率及其相關(guān)關(guān)系進(jìn)行了研究，深入揭示了蛋白質(zhì)的α螺旋、β折疊及其比例關(guān)系與蛋白質(zhì)溶解性、蛋白質(zhì)消化率間的關(guān)系(表1)，為客觀分析蛋白質(zhì)飼用價(jià)值和飼料蛋白質(zhì)源結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供了重要的基礎(chǔ)。

龍國徽等［26］應(yīng)用FTIR光譜法和拉曼光譜法對大豆球蛋白等大豆抗原蛋白的子結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，與FTIR光譜相比拉曼光譜指紋區(qū)的數(shù)據(jù)峰較多，拉曼光譜可以解析出更多的分子結(jié)構(gòu)信息。大豆球蛋白二級結(jié)構(gòu)中主要成分的β-折疊的2種光譜結(jié)果一致，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲的結(jié)果差異顯著。

圖2 蛋白質(zhì)的主要二級結(jié)構(gòu)——α螺旋(A)、β折疊(B)和無規(guī)卷曲(C)Fig.2 The main of protein secondary structure—α-helix(A)，β-sheet(B)and random coil(C)［20］

表1 不同飼料蛋白二級結(jié)構(gòu)與可消化性間的關(guān)系Table 1 The relationship between secondary structure and digestibility of different feedstuff proteins［25］

Long等［27］在熱變性大豆球蛋白的分子結(jié)構(gòu)紅外光譜研究中發(fā)現(xiàn)，120℃蒸汽處理比120℃烘干處理大豆球蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化更顯著，并且分子聚集更強(qiáng)。這些變化都是影響蛋白酶消化大豆球蛋白的重要因素。

3 飼料蛋白質(zhì)抗?fàn)I養(yǎng)特性的生物學(xué)評價(jià)

3.1 飼料中的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子

飼料蛋白質(zhì)的抗?fàn)I養(yǎng)特性，在動物營養(yǎng)領(lǐng)域主要是指飼料或代謝產(chǎn)物所含有的抗?fàn)I養(yǎng)因子和抗酶解肽物質(zhì)對養(yǎng)分消化吸收、代謝及動物健康和生產(chǎn)性能產(chǎn)生負(fù)面影響的特性體現(xiàn)。

一些飼料，尤其是未經(jīng)處理或熱處理不夠的大豆及其餅粕和其他豆科籽實(shí)，含有多種抗因營養(yǎng)因子(表3)。其中一些熱不穩(wěn)定性抗?fàn)I養(yǎng)因子在加工過程中可有效去除，但一些熱穩(wěn)定性抗?fàn)I養(yǎng)因子(如大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白等致敏蛋白)在常規(guī)加工處理過程中難以去除，危害動物的生理健康，限制蛋白質(zhì)的安全、高效利用［28］。

表3 常見植物原料中的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子Table 3 The main anti-nutritional factors in the common plant material［29］

3.2 部分蛋白質(zhì)類抗?fàn)I養(yǎng)因子的分子特征研究

β-伴大豆球蛋白是大豆中難以去除且危害較大的抗?fàn)I養(yǎng)因子之一。研究表明β-伴大豆球蛋白熱穩(wěn)定性強(qiáng)，且在動物消化道內(nèi)隨著蛋白質(zhì)的降解其免疫活性反而存在升高現(xiàn)象［30］。Zhao等［31］著眼于酶解過程中β-伴大豆球蛋白分子結(jié)構(gòu)與免疫活性的關(guān)系及變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)β-伴大豆球蛋白經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶先后水解后，盡管β亞基被有效降解，但同時(shí)也產(chǎn)生了一些抗酶解肽段，這些肽段上存在著完整的免疫球蛋白E(IgE)、免疫球蛋白G(IgG)抗體結(jié)合表位，能夠直接到達(dá)胃腸黏膜，刺激機(jī)體產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，從而引 起 敏 反 應(yīng)。Stanley 等［32］、王 俊 等［33］、Zheng等［34］的研究也發(fā)現(xiàn)了類似規(guī)律。

4 小結(jié)

對飼料中營養(yǎng)物質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值的認(rèn)識過程也遵循著人類認(rèn)識客觀世界的一般規(guī)律，既去粗取精、去偽存真、從現(xiàn)象到本質(zhì)的漸進(jìn)過程。飼料中營養(yǎng)物質(zhì)對動物的營養(yǎng)價(jià)值和營養(yǎng)特性與其物理特征、化學(xué)結(jié)構(gòu)、化學(xué)性質(zhì)存在著必然的根本性的聯(lián)系。通過檢測飼料的物理化學(xué)特性來尋求簡便快捷的方法，進(jìn)一步精確評價(jià)飼料中營養(yǎng)素對動物的營養(yǎng)價(jià)值，這是一個(gè)涉及多方面知識、內(nèi)容非常復(fù)雜、體量比較龐大的科學(xué)技術(shù)問題，也是一個(gè)具有重大潛在意義的研究領(lǐng)域?？赡苁怯捎谡J(rèn)識或研究條件等方面的原因，這一問題尚未得到足夠廣泛和深入的研究。

近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，尤其是一些特殊高性能儀器設(shè)備的出現(xiàn)和對物質(zhì)的物理特征、化學(xué)結(jié)構(gòu)等觀察測定新方法的建立，以及學(xué)科領(lǐng)域之間交叉與融合的創(chuàng)新理念的驅(qū)動，原來覺得難以解決的一些復(fù)雜問題現(xiàn)在正在變得越來越簡單。所以，國內(nèi)外已有人開始從不同的層面和不同的角度對這方面的有關(guān)問題開展了一些局部的、零星的探索性研究。從一般的科學(xué)邏輯分析和已有的研究結(jié)果看，這方面的研究具有很大的理論實(shí)用價(jià)值。積極深入地對這方面的問題開展研究，對于解決我國畜牧業(yè)發(fā)展面臨的資源問題、環(huán)境問題和生產(chǎn)力水平提高問題均具有重要意義。

開展這方面的研究需要多方面的合作和有效的創(chuàng)新機(jī)制。研究的整體內(nèi)容框架應(yīng)該由以下幾個(gè)方面構(gòu)成:1)物理化學(xué)指標(biāo)的搜索、收集、優(yōu)選;2)儀器設(shè)備的選用、研制及測定方法、測定標(biāo)準(zhǔn)的建立;3)原料的分析化驗(yàn)指標(biāo)與動物消化、代謝結(jié)果的關(guān)聯(lián)研究;4)原料養(yǎng)分理化特性與動物生命過程關(guān)系及營養(yǎng)機(jī)制研究;5)多維理化變量與營養(yǎng)功能之間的復(fù)雜數(shù)量關(guān)系模型的建立;6)原料樣品的批量測定及數(shù)據(jù)庫的信息補(bǔ)充完善或新體系的建立。

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