周 廣 麒，齊 文 茂，陳 成，曹 照 平，王 興，曲 世 奇

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034)

0 引 言

葡萄渣中含有20%左右的纖維物質(zhì)。利用葡萄渣生產(chǎn)飼料其有效營養(yǎng)組分并不充足，且應(yīng)考慮到纖維素降解問題[1]。近些年來，纖維素酶制劑用于發(fā)酵飼料已被接受，不僅可以有效降低飼料中的纖維素含量，同時(shí)也能改善飼料的適口性[2]。香菇菌是著名的食用真菌，菌體內(nèi)含有多種氨基酸、維生素和礦質(zhì)元素，同時(shí)還具有產(chǎn)生纖維素酶的能力[3－4]。發(fā)酵飼料時(shí)所用的酵母菌也是安全食用菌。利用酵母菌發(fā)酵可以軟化植物組織，其與香菇共同作用，更可將纖維素降解時(shí)生成的糖發(fā)酵成其他代謝產(chǎn)物，同時(shí)繁殖大量生物細(xì)胞，提高飼料中蛋白含量及品質(zhì)[5－6]，顯著改善發(fā)酵飼料的營養(yǎng)價(jià)值。本文研究了香菇菌和葡萄酒酵母菌共生發(fā)酵葡萄皮渣產(chǎn)生纖維素酶的條件。

1 材料與方法

1.1 材 料

冰葡萄渣，遼寧五女山米蘭酒業(yè)有限公司提供。將冰葡萄渣置于室溫下解凍，去枝干及殘留土石塊，經(jīng)研磨成果漿備用。

麩皮，由大連棒棰島食品集團(tuán)調(diào)味食品廠提供。

香菇，市場購買由人工栽培的香菇子實(shí)體，要求生長飽滿、完整，分離純化所得，保藏。

“安琪”葡萄酒活性干酵母，廠家網(wǎng)絡(luò)銷售。

1.2 培養(yǎng)基

取馬鈴薯200g，去皮、切塊，加水1 000mL，煮沸30min，紗布過濾；分別加入蔗糖20g和瓊脂15～20g，加熱溶化；pH 自然；121℃滅菌20min。

1.2.2 液體培養(yǎng)基

取未加入瓊脂的PDA液體培養(yǎng)基，補(bǔ)加硫酸鎂0.1%，磷酸二氫鉀0.1%[7]，冰葡萄渣3%和麩皮3%，121℃滅菌40min。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 香菇菌的組織分離和活化

采取無菌操作方法，將香菇用75%酒精消毒，在菌蓋和菌柄交界處切取內(nèi)部組織如麥粒大小菌塊，接入PDA培養(yǎng)基的試管斜面中央，于25℃培養(yǎng)15d至白色菌絲長滿斜面[8]。

1.3.2 酵母菌活化

稱取“安琪”葡萄酒活性干酵母0.5g，加入含2%葡萄糖溶液中，27℃活化培養(yǎng)2h，使之進(jìn)入對數(shù)生長期階段。

1.3.3 發(fā)酵試驗(yàn)

法律法規(guī)是離任審計(jì)工作的規(guī)范，相關(guān)人員在法律法規(guī)要求下開展審計(jì)工作，然而我國離任審計(jì)工作起步較晚，造成審計(jì)工作的弊端較多。例如當(dāng)前我國眾多地勘單位的離任審計(jì)工作只是一項(xiàng)書面上的工作，即有關(guān)法定負(fù)責(zé)人只是根據(jù)法律規(guī)范的書寫要求，填寫審計(jì)工作的任務(wù)單，根本就沒有從實(shí)際出發(fā)，發(fā)現(xiàn)自身工作的優(yōu)勢與劣勢，更沒有對工作的合理性展開分析。因此離任審計(jì)工作逐步淪為一種形式性的任務(wù)，即使部分地勘單位審計(jì)工作人員嚴(yán)格執(zhí)行相關(guān)法律法規(guī)，也無法保證審計(jì)工作的過程公開性，最終使問責(zé)的主體人員不明確，這種情況代表工作人員即使發(fā)現(xiàn)問題，也找不到解決的人員與措施，審計(jì)工作成為無用功。

在無菌條件下，向液體培養(yǎng)基中接入1cm2左右試管斜面香菇菌種，25℃、150r／min的搖床培養(yǎng)5d，待發(fā)酵液中大量生長香菇菌絲體時(shí)，接種經(jīng)活化的安琪葡萄酒酵母菌液，繼續(xù)培養(yǎng)3d終止，即為香菇菌－酵母菌共生發(fā)酵液。

1.3.4 纖維素酶活力測定

發(fā)酵液過濾后得到粗酶液。按濾紙酶活力(FPA)測定法[9]，向具塞刻度試管中加入粗酶液1mL和pH 4.5的檸檬酸緩沖液1.5mL，50℃水浴5～10min(預(yù)熱)，然后加入濾紙條(新華定量濾紙)50mg，保溫1h，立刻加入1.5mL DNS終止酶反應(yīng)，檢測OD值并在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出葡萄糖含量，依據(jù)公式計(jì)算出濾紙酶活力。濾紙酶活力定義：在50℃、pH 4.5條件下水解1h纖維素生成1μmol葡萄糖的量，為一個(gè)酶活力單位(U／g)。

式中：m1為纖維素降解所得葡萄糖質(zhì)量，mg；V1為酶液體積，mL；V2為反應(yīng)液中酶液加入量，mL；m2為樣品質(zhì)量，g；t為反應(yīng)時(shí)間，h；5.56為1mg葡萄糖的物質(zhì)的量，μmol。

1.3.5 酵母菌數(shù)的測定

取發(fā)酵液1mL用無菌水倍比稀釋，采用血球計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)法。

1.3.6 香菇菌生物量的測定

用已知質(zhì)量的干燥濾紙過濾發(fā)酵液，蒸餾水沖洗菌絲體3次，將濾紙與香菇菌絲體一起放入烘干箱中，80℃烘干4h，轉(zhuǎn)入干燥器中冷卻至室溫，反復(fù)稱量直至恒重[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 香菇菌和酵母菌共生培養(yǎng)的生物量

在25℃條件下，150r／min搖床培養(yǎng)香菇菌5d，然后接種酵母菌混菌培養(yǎng)72h，分別與香菇菌或酵母菌單菌培養(yǎng)狀態(tài)相比較，生長曲線分別如圖1和圖2所示。

圖1 香菇菌－酵母菌共生培養(yǎng)與香菇菌培養(yǎng)的生長曲線Fig.1 Growth curve of the symbiotic fermentation and Lentinula edodes single strain fermentation

圖2 香菇菌－酵母菌共生培養(yǎng)與酵母菌培養(yǎng)的生長曲線Fig.2 Growth curve of the symbiotic fermentation and the yeast single strain fermentation

由圖1可見，2組培養(yǎng)液中香菇生長狀態(tài)相似，至第8天，共生液中香菇菌生物量為13.6g／L，略高于單生香菇菌的12.3g／L，大概是其中有部分酵母菌的緣故。

由圖2可見，當(dāng)香菇菌培養(yǎng)至第5天時(shí)接種酵母菌，此后72h共生培養(yǎng)液中的酵母菌數(shù)與單生酵母菌數(shù)量幾乎一致，前者為3.64×108個(gè)／mL，后者達(dá)到3.81×108個(gè)／mL，相差不大。經(jīng)鏡檢觀察，共生發(fā)酵液中酵母菌生長狀態(tài)良好。

圖1和圖2表明，香菇菌和酵母菌可以在PDA培養(yǎng)液中生長，且共生情況良好。

2.2 香菇菌－酵母菌共生狀況的顯微觀察

液體PDA培養(yǎng)基中接種香菇菌，在25℃條件下150r／min搖床培養(yǎng)，至第5天接種酵母菌混菌培養(yǎng)72h，共計(jì)8d。從48h開始，每隔24h鏡檢一次。結(jié)果見圖3。從圖3中可見，香菇菌和酵母菌在液體PDA培養(yǎng)基中均生長茂盛、和諧，6d以后鏡下可見大量香菇菌絲體和出芽的酵母菌(圖3(d)、(e)中箭頭所指)。香菇菌絲多以聚集狀態(tài)纏繞在一起，大量菌絲向菌團(tuán)外延伸生長(圖3(d)、(e)、(f))；酵母菌細(xì)胞遍布整個(gè)視野，出芽率為15%左右。

圖3 香菇菌－酵母菌共生培養(yǎng)生長狀況顯微照片F(xiàn)ig.3 The microscopic photograph of Lentinula edodes－yeast symbiotic fungus cultivation

2.3 發(fā)酵過程中香菇生產(chǎn)纖維素酶的情況

在適宜的培養(yǎng)條件下，香菇菌發(fā)酵可以產(chǎn)生纖維素酶以降解培養(yǎng)基中纖維物質(zhì)[11]。在香菇菌－酵母菌共生發(fā)酵過程中，香菇菌生成纖維素酶的能力沒有改變，如圖4所示。由圖4可以看出，0～2d香菇菌發(fā)酵液中纖維素酶活力增長緩慢，第2天時(shí)濾紙酶活力為0.41U／g，2～6d纖維素酶近似于線性增長達(dá)到2.1U／g，而后生成減緩，第8d濾紙酶活力為2.35U／g。

圖4 香菇菌－酵母菌共生發(fā)酵與香菇菌發(fā)酵生成纖維素酶的情況Fig.4 The contrast of producing cellulase between the symbiotic fermentation and the mushroom single strain fermentation

2.4 香菇菌－酵母菌共生最佳培養(yǎng)基質(zhì)的確定

為了得到更好的發(fā)酵效果，采用正交試驗(yàn)法確定香菇菌－酵母菌共生發(fā)酵的最適基質(zhì)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取4個(gè)主要影響生長的因素：葡萄渣質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)、硫酸鎂和磷酸二氫鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)(C)、麩皮質(zhì)量分?jǐn)?shù)(D)。按L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素水平見表1。

表1 基質(zhì)配伍正交試驗(yàn)L9(34)的因素和水平Tab.1 Formula－factors and levels of L9(34)orthogonal test

按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案L9(34)進(jìn)行共生發(fā)酵基質(zhì)的優(yōu)化試驗(yàn)，分別檢測9組試驗(yàn)組合中的香菇菌生物量M，每組2個(gè)平行試驗(yàn)取平均值，結(jié)果見表2。

表2 基質(zhì)配伍L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Formula－results of L9(34)orthogonal experiment

以香菇菌生物量為檢測對象，對表2數(shù)據(jù)做極差分析，將最次要因素D作為空列，再進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 基質(zhì)配伍試驗(yàn)結(jié)果方差分析Tab.3 Formula－variance analysis of orthogonal test result

由表3可知，因素B影響顯著，因素A影響較顯著，因素C對結(jié)果影響很小。因素作用的主次順序是B＞A＞C，最優(yōu)水平組合為A2B3C3，因素D無影響，可選擇D1，即香菇菌－酵母菌共生發(fā)酵主要影響生長的因素最優(yōu)配比為：葡萄渣3%，蔗糖3%，微量元素0.3%，麩皮3%。

因?yàn)樽顑?yōu)組合不在表2的9組試驗(yàn)中，所以在最優(yōu)條件下做驗(yàn)證試驗(yàn)，取2組平行試驗(yàn)結(jié)果的平均值：香菇菌－酵母菌共生培養(yǎng)8d，香菇菌生物量達(dá)到2.31g／L，比優(yōu)化前提高了57.4%，酵母菌細(xì)胞計(jì)數(shù)為4.54×108個(gè)／mL。

2.5 香菇菌－酵母菌共生發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶最佳條件的確定

采用正交試驗(yàn)法對香菇菌－酵母菌共生發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的最佳條件進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)影響酶活力的主要工藝因素，包括溫度、pH、培養(yǎng)時(shí)間等，確定考察的因素為：溫度(G)、pH(H)、發(fā)酵時(shí)間(I)。選擇正交表L9(34)，因素和水平見表4。

表4 發(fā)酵條件L9(34)正交試驗(yàn)的因素和水平Tab.4 Fermentation condition－factors and levels of L9(34)orthogonal test

按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案L9(34)進(jìn)行共生發(fā)酵條件的優(yōu)化試驗(yàn)，分別檢測9組試驗(yàn)組合的纖維素酶量，每組2個(gè)平行試驗(yàn)取平均值，結(jié)果見表5。J為空列。

表5 發(fā)酵條件L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Fermentation condition－results of L9(34)orthogonal experiment

以纖維素酶為檢測對象，對表5數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表6。

表6 發(fā)酵條件試驗(yàn)結(jié)果方差分析Tab.6 Fermentation condition－variance analysis of orthogonal test result

由表6數(shù)據(jù)可見，因素H和因素G對結(jié)果影響顯著，尤其是因素H；因素I對結(jié)果影響不大。因素作用的主次順序是H＞G＞I，其產(chǎn)纖維素酶的最優(yōu)條件為G3H1I3，即溫度27℃，pH 5.5，發(fā)酵時(shí)間3～5d。

由于最優(yōu)組合不在表5的試驗(yàn)組合中，所以做驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果是：采取A2B3C3D1的最佳基質(zhì)配方，共生發(fā)酵3d，纖維素酶活3.2U／g，此時(shí)香菇菌生物量為21.4g／L，酵母菌細(xì)胞計(jì)數(shù)為3.61×108個(gè)／mL，符合正交試驗(yàn)的預(yù)期結(jié)果。實(shí)際做法是，將香菇菌在25℃條件下培養(yǎng)5d，然后升溫到27℃培養(yǎng)，此時(shí)接種酵母菌共生培養(yǎng)，香菇菌開始快速生成纖維素酶，發(fā)酵至第8天結(jié)束，即可滿足生產(chǎn)要求。

3 結(jié) 論

對香菇菌與酵母菌共生發(fā)酵條件進(jìn)行了初步探索，證明香菇菌和酵母菌可以共生，香菇菌產(chǎn)生的纖維素酶能降解葡萄渣培養(yǎng)基中的纖維物質(zhì)[12]生成可發(fā)酵性糖，被酵母菌所利用，可以生長菌體和發(fā)酵產(chǎn)物。將香菇和酵母菌混合，利用優(yōu)化后的共生發(fā)酵液制成微生物發(fā)酵劑，可用于降解草本或木本植物中的纖維物質(zhì)，從而達(dá)到軟化原料、提高原料利用率的效果。將這種方法用于飼料生產(chǎn)，既可以在飼料中使用更多的纖維原料，又能獲得大量生物質(zhì)蛋白，還會(huì)增加醇酯等風(fēng)味，提高飼料的適口性。

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