賀瑩+王曉冬+喬元彪

摘 要：通過篩菌得到一株野生菌 LLV-6，在誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后利用DL-對羥基苯海因（DL-HPH）為底物經(jīng)D-海因酶（HYD）和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶（CAB）兩酶水解而獲得D-對羥基苯甘氨酸。用LB培養(yǎng)基（含磷酸鹽緩沖溶液，pH=7.2）接菌量為0.5%（對數(shù)期的菌種），在37℃、200r、pH7.2條件下培養(yǎng)菌種。在培養(yǎng)12h后加入2%的誘導(dǎo)劑并以500μLDMSO作為促溶劑，33h后收集細(xì)胞。通過對細(xì)胞酶活力的測定，此時(shí)酶活力達(dá)到最大值，酶活力為0.57U/L，比優(yōu)化前提高了2.6倍。

關(guān)鍵詞：D-對羥基苯甘氨酸；時(shí)間誘導(dǎo)；濃度誘導(dǎo)；酶活力

中圖分類號Q55 文獻(xiàn)標(biāo)識碼A 文章編號1007-7731（2014）14-24-03

The Optimization of Fermentation Process of DL-Hydroxyphenyl Hydantoin Bacterial

He Ying et al.

（Department of Life Science，Lvliang College，Lvliang 033000，China）

Abstract:Through the sieve bacteria get one natural bacteria LLV-6，In inducers induced effect after using the DL-Hydroxyphenyl Hydantoin（DL-HPH） as the substrate by D-hydantoinase（HYD）and N-carbamoylase（CAB）two enzyme hydrolysis of D-p-Hydroxyphenylglycine（D-HPG）. Using LB culture medium（containing phosphate buffer solution，pH=7.2）the inoculation quantity was 0.5%（Logarithmic phase），the bacteria cultured at 37℃，200r，pH7.2 conditions. In 12 hours after adding 2% inducers and with DMSO as solvent，33 hours after collection of the cell. By measuring the enzyme activity of the cells，the enzyme activity reached a maximum value at this time，Enzyme activity was 0.57U/L，more than 2.6 times before optimization.

Key words：D-p-hydroxyphenylglycine；Induction time；Concentration induced；Enzyme activity

D-對羥基苯甘氨酸（D-p-Hydroxyphenylglycine，D-HPG）是主要用作合成青霉素和半合成頭孢菌素類藥物的側(cè)鏈化合物。用其生產(chǎn)的主要藥品有羥氨芐青霉素（阿莫西林）、羥氨芐青霉素克拉維酸鹽、羥氨芐頭孢、羥氨芐唑頭孢、頭孢哌酮、頭孢曲嗪等，這些藥物用途廣泛，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、弓形菌、螺旋體等均有殺滅作用；還應(yīng)用于感光領(lǐng)域和用作鐵、磷、硅等的分析試劑，需求量呈逐年遞增趨勢[1-2]。目前對羥基苯甘氨酸的生產(chǎn)工藝有化學(xué)法和生物法2種。生物法是先以化學(xué)合成的DL-對羥基苯海因作為生物酶作用的底物，利用D-海因酶（HYD）和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶（CAB）這2個(gè)酶連續(xù)反應(yīng)作用于底物制備D-對羥基苯甘氨酸。首先，HYD催化海因或其衍生物5，單替代海因生成氨甲酞基衍生物，然后CAB接著作用于該中間產(chǎn)物使其水解脫去氨甲酞基從而生成D-對羥基苯甘氨酸[3-5]。本實(shí)驗(yàn)以一株天然菌LLV-6，在誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后利用DL-對羥基苯海因（DL-HPH）為底物經(jīng)水解后可獲得D-對羥基苯甘氨酸。筆者在測得LLV-6的生長曲線后，通過不同時(shí)間點(diǎn)加入相同誘導(dǎo)劑對酶活力影響的實(shí)驗(yàn)和相同的時(shí)間點(diǎn)加入不同濃度誘導(dǎo)劑對酶活力影響的實(shí)驗(yàn)，確定其誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑的濃度，以期為該法工業(yè)化生產(chǎn)D-對羥基苯甘氨酸提供技術(shù)參數(shù)[6]。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑 出發(fā)菌株：菌種LLV-6，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。LB液體培養(yǎng)基：1.0%胰蛋白胨，0.5%酵母浸膏，1.0%NaCl（pH7.2）。LB固體培養(yǎng)基為在上述LB液體培養(yǎng)基中添加1.5%瓊脂粉。試驗(yàn)試劑：二甲基亞砜（DMSO）、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、乙腈、磷酸、對羥基苯海因、對羥基苯甘氨酸、瓊脂等試劑為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水經(jīng)超純水裝置再處理后的超純水。

1.2 儀器與設(shè)備 振蕩培養(yǎng)箱（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）、UV-2100雙光束紫外可見分光光度計(jì)（上海棱光有限公司）、潔凈工作臺（上海博訊有限公司）、高效液相色譜儀（北京北分瑞利分析儀器有限責(zé)任公司）、立式壓力蒸汽滅菌器筒（上海博訊有限公司）、臺式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）、臺式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）、旋渦混合器（Daihan scientific）、反滲透純水系統(tǒng)、OLYMPUS BX41正置系統(tǒng)金相顯微鏡、電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、智能型冷藏箱（寧波市科技園區(qū)新江南儀器有限公司）、J1000型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）、電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）、電子調(diào)溫電熱套（重慶市吉祥教學(xué)設(shè)備有限公司）、數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊有限公司）、KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、LGJ-10冷凍干燥機(jī)（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）、恒溫水浴鍋（寧波市新芝科器研究所）。

1.3 方法

1.3.1 野生菌LLV-6生長曲線的測定 將4℃保存的野生菌LLV-6于固體LB平板劃線，37℃培養(yǎng)過夜。次日挑取單菌落接種于100mL LB培養(yǎng)液（含磷酸鹽緩沖液）中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時(shí)作為種子液。以0.5%接種量分別接種三角瓶培養(yǎng)基中，每2h測定一次，一次測3瓶，測其平均值，直到OD值下降，然后繪制生長曲線。

1.3.2 野生菌LLV-6的培養(yǎng) 挑取單菌落接種于100mL LB培養(yǎng)液（含磷酸鹽緩沖液）中，37℃振蕩培養(yǎng)OD600為0.6～0.8時(shí)，再以0.5%接種量接種到三角瓶中，37℃擴(kuò)大培養(yǎng)至12h，加入2%的對羥基苯海因并加入促溶劑DMSO，再在37℃繼續(xù)培養(yǎng)16～18h，即可離心收集菌體細(xì)胞后進(jìn)行冷凍干燥。

1.3.3 對羥基苯甘氨酸和對羥基苯海因標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 對羥基苯甘氨酸在水中微溶，在10mL水中加入對羥基苯甘氨酸0.01g使其濃度為0.1%。通過加水稀釋使對羥基苯甘氨酸濃度分別為0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%，并且編號1～9，濃度為0.1%的編號為10號。通過高效液相色譜儀，分別測定其峰電平值。最后繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。用同樣的方法測定對羥基苯海因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

1.3.4 不同時(shí)間點(diǎn)加入相同誘導(dǎo)劑對酶活力的影響 通過繪制的生長曲線，在不同時(shí)間點(diǎn)加入相同的誘導(dǎo)劑分別測定其酶的活力。以0.5%接種量，加誘導(dǎo)劑的時(shí)間點(diǎn)分別為4h、6h、8h、10h、12h、16h、20h。培養(yǎng)28～30h后離心收集菌體細(xì)胞后進(jìn)行冷凍干燥，收集菌體備用測定酶活。

1.3.5 在相同的時(shí)間點(diǎn)加入不同濃度誘導(dǎo)劑對酶活力的影響 確定了加入誘導(dǎo)劑時(shí)間點(diǎn)后，在相同的時(shí)間點(diǎn)加入不同濃度誘導(dǎo)劑分別測定其酶的活力。在確定的時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)基中加入相同0.5%的促溶劑DMSO，但對羥基苯海因的量分別為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%，并全部以0.5%接種量。培養(yǎng)28～30h后離心收集菌體細(xì)胞后進(jìn)行冷凍干燥，收集菌體備用測定酶活。

1.3.6 水解酶活的測定 取一定量的細(xì)胞和以對羥基苯海因?yàn)榈孜镌?5℃、200r/min、pH7～8的無氧體系的條件下進(jìn)行水解實(shí)驗(yàn)。一段時(shí)間后取1mL的菌液在10 000r/min、10min離心后取上清液，通過高效液相色譜儀和對羥基苯甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線測定酶活[7-8]。酶活力單位定義：1min內(nèi)生成1mg D-對羥基苯甘氨酸所需酶量為1個(gè)酶活單位（U）。

1.3.7 驗(yàn)證試驗(yàn) 用LB培養(yǎng)基（含磷酸鹽緩沖溶液，pH=7.2）接菌量為0.5%（對數(shù)期的菌種），在37℃、200r、pH7.2條件下培養(yǎng)菌種。在培養(yǎng)12h后加入2%的誘導(dǎo)劑，并以500μLDMSO作為促溶劑，33h后收集細(xì)胞，測定細(xì)胞酶活力的，平均測3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生菌LLV-6生長曲線的測定 由圖1可知，該菌的對數(shù)期為3～16h，穩(wěn)定期為16～36h，之后衰退。

圖1 LLV-6生長曲線

2.2 對羥基苯甘氨酸和對羥基苯海因的標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 詳見圖2、圖3。

圖2 對羥基苯甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 對羥基苯海因標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 不同時(shí)間點(diǎn)加入相同誘導(dǎo)劑對酶活力的影響 由圖4可知，以接菌量為0.5%接入菌后第12h左右加入誘導(dǎo)劑（含促溶劑）效果最好，酶活最高，而其他時(shí)間點(diǎn)加入酶活則沒有在第12h左右高。原因可能是在第12h為該菌的生長對數(shù)期的中后期，此時(shí)已經(jīng)有大量細(xì)胞并且生長旺盛，在誘導(dǎo)劑的作用下產(chǎn)生誘導(dǎo)酶。

圖4 不同時(shí)間點(diǎn)加入誘導(dǎo)劑對酶活力的影響

2.4 相同的時(shí)間點(diǎn)加入不同濃度誘導(dǎo)劑對酶活力的影響 由圖5可知，以接菌量為0.5%接入菌后第12h左右加入0.2%的誘導(dǎo)劑（含促溶劑）效果最好，酶活最高。

圖5 相同的時(shí)間點(diǎn)加入不同濃度誘導(dǎo)劑對酶活力的影響

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 在本試驗(yàn)設(shè)定的工藝下，平均酶活力達(dá)到了0.57U/L，比優(yōu)化前提高了2.6倍。

參考文獻(xiàn)

[1]ShigeruM，H iromi S，ShindouM，et al.Synthesis and her bicidalactivity of deoxy derivatives of（+）hydantocidin[J].Agric BiolChem，1991，55：1105-1109.

[2]Kenzo Y，Shigeru N.Optimal conditions for the enzy-matic production of D-amino acids from the correspond-ing 5 substituted hydantoin[J].Agric Biol Chem，1987（54）:715-719.

[3]董妍玲，譚新國，潘學(xué)武.海因酶法制備D-對羥基苯甘氨酸的研究進(jìn)展[J].Amino Acids& Biotic Resources，2009，31（3）：47-52

[4]ChaoYP，Chiang CJ，ChenPT.Optimum ratio of D-carbamoylase to D-hydantoinase for maxim izing D-p-hydroxyphenylglycine productivity[J]. BiotechnologyLetters，2000，22：99-103.

[5]呂彬峰，錢俊青，應(yīng)雪肖.海因酶產(chǎn)生菌的反應(yīng)條件研究[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，35：505-508.

[6]WANG Xiaoping，XING Shuli，Coomassie brilliant blue method was developed for the determination of protein content in research[J].Tianjin Chemical Industry，2009，23（3）.

[7]宋慧敏，屠春燕，歐陽平凱.高效液相色譜法測定D-對羥基苯甘氨酸[J].南京工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2002，24（4）：97-99.

[8] Niu LX，Zhang XY，Shi YW，et al. Subunit dissociationand stability alteration of D-hydantoinase deleted at theterminal amino acid residue[J].Biotechnol Lett，2007，29（2）：303-308.

[9]江南，吳開力，黃強(qiáng)，等.一種簡便的考馬斯亮藍(lán)G250蛋白質(zhì)染色方法[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2000，27（5）：560-563.

（責(zé)編：張宏民）

1.3.4 不同時(shí)間點(diǎn)加入相同誘導(dǎo)劑對酶活力的影響 通過繪制的生長曲線，在不同時(shí)間點(diǎn)加入相同的誘導(dǎo)劑分別測定其酶的活力。以0.5%接種量，加誘導(dǎo)劑的時(shí)間點(diǎn)分別為4h、6h、8h、10h、12h、16h、20h。培養(yǎng)28～30h后離心收集菌體細(xì)胞后進(jìn)行冷凍干燥，收集菌體備用測定酶活。

1.3.5 在相同的時(shí)間點(diǎn)加入不同濃度誘導(dǎo)劑對酶活力的影響 確定了加入誘導(dǎo)劑時(shí)間點(diǎn)后，在相同的時(shí)間點(diǎn)加入不同濃度誘導(dǎo)劑分別測定其酶的活力。在確定的時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)基中加入相同0.5%的促溶劑DMSO，但對羥基苯海因的量分別為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%，并全部以0.5%接種量。培養(yǎng)28～30h后離心收集菌體細(xì)胞后進(jìn)行冷凍干燥，收集菌體備用測定酶活。

1.3.6 水解酶活的測定 取一定量的細(xì)胞和以對羥基苯海因?yàn)榈孜镌?5℃、200r/min、pH7～8的無氧體系的條件下進(jìn)行水解實(shí)驗(yàn)。一段時(shí)間后取1mL的菌液在10 000r/min、10min離心后取上清液，通過高效液相色譜儀和對羥基苯甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線測定酶活[7-8]。酶活力單位定義：1min內(nèi)生成1mg D-對羥基苯甘氨酸所需酶量為1個(gè)酶活單位（U）。

1.3.7 驗(yàn)證試驗(yàn) 用LB培養(yǎng)基（含磷酸鹽緩沖溶液，pH=7.2）接菌量為0.5%（對數(shù)期的菌種），在37℃、200r、pH7.2條件下培養(yǎng)菌種。在培養(yǎng)12h后加入2%的誘導(dǎo)劑，并以500μLDMSO作為促溶劑，33h后收集細(xì)胞，測定細(xì)胞酶活力的，平均測3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生菌LLV-6生長曲線的測定 由圖1可知，該菌的對數(shù)期為3～16h，穩(wěn)定期為16～36h，之后衰退。

圖1 LLV-6生長曲線

2.2 對羥基苯甘氨酸和對羥基苯海因的標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 詳見圖2、圖3。

圖2 對羥基苯甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 對羥基苯海因標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 不同時(shí)間點(diǎn)加入相同誘導(dǎo)劑對酶活力的影響 由圖4可知，以接菌量為0.5%接入菌后第12h左右加入誘導(dǎo)劑（含促溶劑）效果最好，酶活最高，而其他時(shí)間點(diǎn)加入酶活則沒有在第12h左右高。原因可能是在第12h為該菌的生長對數(shù)期的中后期，此時(shí)已經(jīng)有大量細(xì)胞并且生長旺盛，在誘導(dǎo)劑的作用下產(chǎn)生誘導(dǎo)酶。

圖4 不同時(shí)間點(diǎn)加入誘導(dǎo)劑對酶活力的影響

2.4 相同的時(shí)間點(diǎn)加入不同濃度誘導(dǎo)劑對酶活力的影響 由圖5可知，以接菌量為0.5%接入菌后第12h左右加入0.2%的誘導(dǎo)劑（含促溶劑）效果最好，酶活最高。

圖5 相同的時(shí)間點(diǎn)加入不同濃度誘導(dǎo)劑對酶活力的影響

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 在本試驗(yàn)設(shè)定的工藝下，平均酶活力達(dá)到了0.57U/L，比優(yōu)化前提高了2.6倍。

參考文獻(xiàn)

[1]ShigeruM，H iromi S，ShindouM，et al.Synthesis and her bicidalactivity of deoxy derivatives of（+）hydantocidin[J].Agric BiolChem，1991，55：1105-1109.

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[4]ChaoYP，Chiang CJ，ChenPT.Optimum ratio of D-carbamoylase to D-hydantoinase for maxim izing D-p-hydroxyphenylglycine productivity[J]. BiotechnologyLetters，2000，22：99-103.

[5]呂彬峰，錢俊青，應(yīng)雪肖.海因酶產(chǎn)生菌的反應(yīng)條件研究[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，35：505-508.

[6]WANG Xiaoping，XING Shuli，Coomassie brilliant blue method was developed for the determination of protein content in research[J].Tianjin Chemical Industry，2009，23（3）.

[7]宋慧敏，屠春燕，歐陽平凱.高效液相色譜法測定D-對羥基苯甘氨酸[J].南京工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2002，24（4）：97-99.

[8] Niu LX，Zhang XY，Shi YW，et al. Subunit dissociationand stability alteration of D-hydantoinase deleted at theterminal amino acid residue[J].Biotechnol Lett，2007，29（2）：303-308.

[9]江南，吳開力，黃強(qiáng)，等.一種簡便的考馬斯亮藍(lán)G250蛋白質(zhì)染色方法[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2000，27（5）：560-563.

（責(zé)編：張宏民）

1.3.4 不同時(shí)間點(diǎn)加入相同誘導(dǎo)劑對酶活力的影響 通過繪制的生長曲線，在不同時(shí)間點(diǎn)加入相同的誘導(dǎo)劑分別測定其酶的活力。以0.5%接種量，加誘導(dǎo)劑的時(shí)間點(diǎn)分別為4h、6h、8h、10h、12h、16h、20h。培養(yǎng)28～30h后離心收集菌體細(xì)胞后進(jìn)行冷凍干燥，收集菌體備用測定酶活。

1.3.5 在相同的時(shí)間點(diǎn)加入不同濃度誘導(dǎo)劑對酶活力的影響 確定了加入誘導(dǎo)劑時(shí)間點(diǎn)后，在相同的時(shí)間點(diǎn)加入不同濃度誘導(dǎo)劑分別測定其酶的活力。在確定的時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)基中加入相同0.5%的促溶劑DMSO，但對羥基苯海因的量分別為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%，并全部以0.5%接種量。培養(yǎng)28～30h后離心收集菌體細(xì)胞后進(jìn)行冷凍干燥，收集菌體備用測定酶活。

1.3.6 水解酶活的測定 取一定量的細(xì)胞和以對羥基苯海因?yàn)榈孜镌?5℃、200r/min、pH7～8的無氧體系的條件下進(jìn)行水解實(shí)驗(yàn)。一段時(shí)間后取1mL的菌液在10 000r/min、10min離心后取上清液，通過高效液相色譜儀和對羥基苯甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線測定酶活[7-8]。酶活力單位定義：1min內(nèi)生成1mg D-對羥基苯甘氨酸所需酶量為1個(gè)酶活單位（U）。

1.3.7 驗(yàn)證試驗(yàn) 用LB培養(yǎng)基（含磷酸鹽緩沖溶液，pH=7.2）接菌量為0.5%（對數(shù)期的菌種），在37℃、200r、pH7.2條件下培養(yǎng)菌種。在培養(yǎng)12h后加入2%的誘導(dǎo)劑，并以500μLDMSO作為促溶劑，33h后收集細(xì)胞，測定細(xì)胞酶活力的，平均測3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生菌LLV-6生長曲線的測定 由圖1可知，該菌的對數(shù)期為3～16h，穩(wěn)定期為16～36h，之后衰退。

圖1 LLV-6生長曲線

2.2 對羥基苯甘氨酸和對羥基苯海因的標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 詳見圖2、圖3。

圖2 對羥基苯甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 對羥基苯海因標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 不同時(shí)間點(diǎn)加入相同誘導(dǎo)劑對酶活力的影響 由圖4可知，以接菌量為0.5%接入菌后第12h左右加入誘導(dǎo)劑（含促溶劑）效果最好，酶活最高，而其他時(shí)間點(diǎn)加入酶活則沒有在第12h左右高。原因可能是在第12h為該菌的生長對數(shù)期的中后期，此時(shí)已經(jīng)有大量細(xì)胞并且生長旺盛，在誘導(dǎo)劑的作用下產(chǎn)生誘導(dǎo)酶。

圖4 不同時(shí)間點(diǎn)加入誘導(dǎo)劑對酶活力的影響

2.4 相同的時(shí)間點(diǎn)加入不同濃度誘導(dǎo)劑對酶活力的影響 由圖5可知，以接菌量為0.5%接入菌后第12h左右加入0.2%的誘導(dǎo)劑（含促溶劑）效果最好，酶活最高。

圖5 相同的時(shí)間點(diǎn)加入不同濃度誘導(dǎo)劑對酶活力的影響

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 在本試驗(yàn)設(shè)定的工藝下，平均酶活力達(dá)到了0.57U/L，比優(yōu)化前提高了2.6倍。

參考文獻(xiàn)

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（責(zé)編：張宏民）