李 明，徐向東

(山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，濟南250011)

四逆散對慢性應激抑郁模型大鼠行為學及神經(jīng)遞質的影響

李 明，徐向東*

(山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，濟南250011)

目的 觀察四逆散對抑郁模型大鼠行為學及神經(jīng)遞質(5-HT、NE、DA)含量的影響。方法 采用慢性輕度不可預見性應激制備大鼠抑郁模型，50只SD雄性大鼠隨機分為正常組、模型組、鹽酸文拉法辛(12.5 mg/kg)組、四逆散(10，5 g/kg)組。連續(xù)灌胃給藥3周，糖水偏愛實驗和open-field實驗測定動物行為學，利用熒光分光光度法檢測下丘腦中的5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)和多巴胺(DA)的含量，探討四逆散的抗抑郁作用及機制。結果 與正常組相比，模型組大鼠體質量、蔗糖水偏嗜度、open-field實驗得分明顯偏低，下丘腦中5-HT、NE和DA的含量低于正常組;與模型組相比，四逆散(10，5 g/kg)組大鼠體質量、蔗糖水偏嗜度、openfield實驗得分明顯增加，下丘腦中神經(jīng)遞質(5-HT、NE和DA)的含量明顯偏高。結論 四逆散可明顯改善抑郁模型大鼠的抑郁狀態(tài)，表現(xiàn)出抗抑郁作用，其機制可能與調節(jié)下丘腦神經(jīng)遞質含量有關。

四逆散;下丘腦;5-羥色胺;去甲腎上腺素;多巴胺

目前，抑郁癥已成為危害人類健康的常見?。?-2］。對于抑郁癥的治療主要以西藥，三環(huán)類抗抑郁制劑、單胺氧化酶抑制劑、選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑等為主，雖有一定的療效，但毒副作用較多。近年來，中醫(yī)藥在治療抑郁癥方面顯示了巨大的優(yōu)勢，療效確切，毒副作用少。抑郁癥屬于中醫(yī)“情志疾病”中的“郁證”，臨證治以疏肝理氣、清肝瀉火、補益心脾、滋養(yǎng)肝腎等。四逆散主要由柴胡、芍藥、枳實、甘草4味藥組成，是調和肝脾的代表方劑。本實驗通過慢性應激制造大鼠肝郁氣滯型抑郁模型，通過大鼠體質量變化、行為學測試和神經(jīng)遞質的變化來探討四逆散治療抑郁癥的主要作用機制。

1 材料

1.1 動物 清潔級健康SD雄性大鼠50只，體質量180～200 g，由山東中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，批號為SCXK(魯)20090001。

1.2 藥物 四逆散由柴胡、枳實、芍藥、炙甘草組成，比例為1∶1∶1∶1;購于山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，并經(jīng)張學順教授鑒定。取四逆散各180 g(共30劑)，加10倍量的水浸泡1 h后煎煮，沸騰后文火煎40 min，過濾;第2次加8倍量水煎煮，水沸后用文火煎40 min，過濾，合并濾液，常壓濃縮至濃度為50%、100%的藥液(即含原生藥材0.5，1.0 g/mL煎出物)，冷卻后密封，4℃保存?zhèn)溆?。鹽酸文拉法辛膠囊(蘇州第四制藥廠有限公司，批號20120206)。

1.3 儀器 TC-512型切片機(德國Lezi公司)，DT5-3型低速自動平衡離心機(北京時代北利離心機有限公司)，電子秤(賽多利斯科學儀器有限公司)，DW-86L628型海爾超低溫保存箱(－80℃，青島海爾特種電器有限公司)，BCD-186K型4℃冰箱(海信北京電器有限公司)，RF-530熒光檢測器(日本島津公司)。

2 方法

2.1 分組 對Wistar大鼠進行標記，稱重，隨機分為正常組、模型組、鹽酸文拉法辛組、四逆散低劑量組和四逆散高劑量組。適應性飼養(yǎng)1周后開始造模。

2.2 造模 造模共持續(xù)3周，參照文獻［3］的方法，以慢性不可預見性的溫和刺激，配合孤養(yǎng)，7種不同的刺激按隨機方法在21 d內應用:電擊足底(36 V電壓，每隔5 s電擊1次，持續(xù)10 s/次，共給予20次)、禁食 24 h、禁水 24 h、夾尾 5 min、4℃冰水游泳10 min、晝夜顛倒、45℃傾斜鼠籠24 h。每天隨機給予1種刺激，相同的刺激不能連續(xù)出現(xiàn)，使小鼠不能預料刺激的發(fā)生，平均每種刺激給予3次。

2.3 體質量測量 每周測量1次。

2.4 灌胃治療 造模3周后，正常組和模型組灌胃蒸餾水;鹽酸文拉法辛組灌胃鹽酸文拉法辛溶液(12.5 mg/kg);四逆散低劑量組灌胃5 g/kg的四逆散水煎液;四逆散高劑量組灌胃10 g/kg的四逆散水煎液。灌胃同時，除正常組外，其余各組繼續(xù)接受刺激。

2.5 行為學測試

2.5.1 蔗糖水偏嗜度 共測量3次，分別在第0，21，42天。斷水12 h后在鼠籠上放置質量分數(shù)為1%的蔗糖水和蒸餾水2瓶，使其自由飲用，分別稱量1 h前后的水瓶質量，計算動物的蔗糖水消耗比例［4］。

2.5.2 open-field敞箱評分 共測量3次，分別在第0，21，42天。Open-field敞箱由木板組成，箱高 40 cm，底面為45 cm×45 cm被分成面積相等的3×3方格的正方形，箱底、內壁均為黑色。實驗時將大鼠逐只放入敞箱中心，以5 min內大鼠穿越敞箱底面的方格數(shù)為水平運動得分(三爪以上跨入)，穿越1個方格記為1分，兩前肢抬起為垂直運動得分(兩前肢離地面1 cm以上)，兩前肢離地1次記為1分。實驗過程中室內安靜，光線柔和，室溫為(24±1)℃，濕度為(55±10)%。每只動物測定完畢后均對敞箱進行徹底清掃以消除氣味對下一只樣本的干擾［5］。

2.6 RP-HPLC-熒光法測定海馬單胺類遞質［6］色譜條件:VP-ODS C18色譜柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流動性0.1 mol/L磷酸二氫鉀-甲醇90∶10;0.45 μm微孔濾膜過濾，超聲脫氣;流速1.0 mL/;柱溫室溫;發(fā)射波長330 nm，激發(fā)波長290 nm;進樣量20 μL。

樣品處理:末次給藥后，禁食不禁水，24 h后斷頭處死大鼠，在冰浴上取出海馬部分，稱重。將稱重后的海馬倒入玻璃勻漿器中，充分研磨使其勻漿化。將勻漿液加入離心管中，加0.4 mol/L高氯酸溶液適量，渦流2 min，置冷凍離心機(4℃)內以10 000 r/min，離心15 min。將離心后的上清液轉入離心管中，再次10 000 r/min，離心10 min，取上清液用0.4 mol/L高氯酸溶液定容至1 mL，渦流混勻，得樣品溶液。按照樣品處理項下的方法操作，取樣品溶液20 μL注入高效液相色譜儀，根據(jù)測得的峰面積按回歸方程計算遞質的含量。2.7統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，用SPSS 17.0進行方差分析。

3 結果

3.1 各組大鼠體質量的變化 見表1。

表1 給藥后各組大鼠體質量變化比較(±s，n=10)g

表1 給藥后各組大鼠體質量變化比較(±s，n=10)g

注:與正常組比較，##P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別 劑量/(g/kg) 第28天 第35天 第42天正常組 — 278.00±8.33 299.40 ±6.10 320.75 ±5.03模型組 — 231.45±5.86## 240.90 ±7.42## 251.50 ±4.64##鹽酸文拉法辛組 12.5/(mg/kg) 242.95±7.04## 258.45±3.69##△△ 276.80±2.61##△△四逆湯低劑量組 5.0 237.35±9.85## 250.95±4.92##△ 263.80±6.67##△四逆湯高劑量組 10.0 240.85±8.28## 255.20±4.50##△△ 270.15±3.06##△△

3.2 各組大鼠的行為學指標

3.2.1 各組大鼠蔗糖水偏嗜度比較 見表2。

表2 各組大鼠蔗糖水偏嗜度比較(±s，n=10)g

表2 各組大鼠蔗糖水偏嗜度比較(±s，n=10)g

注:與正常組比較，##P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別 劑量/(g/kg) 第0天 第21天 第42天正常組 — 93.27 ±1.84 94.63±1.68 95.91 ±1.64模型組 — 93.04 ±3.54 78.51±2.22## 78.75±3.72##鹽酸文拉法辛組 12.5/(mg/kg) 92.47 ±3.21 79.84 ±2.43## 88.53 ±2.16##△△四逆湯低劑量組 5.0 93.34 ±1.50 78.74 ±3.16## 81.44 ±2.22##△四逆湯高劑量組 10.0 94.57 ±2.70 79.74 ±3.29 85.32 ±3.61##△△

3.2.2 Open-field實驗［7］各組大鼠水平得分、垂直得分比較 見表3。

表3 各組大鼠水平得分及垂直得分比較(±s，n=10)g

表3 各組大鼠水平得分及垂直得分比較(±s，n=10)g

注:與正常組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01;與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

組 別 劑量/(g/kg)水平積分第0天 第21天 第42天垂直積分第0天 第21天 第42天正常組 — 55.50 ±5.19 54.00 ±5.29 59.70 ±6.34 12.00 ±2.91 13.00 ±1.94 12.60 ±2.21模型組 — 57.20 ±4.05 39.30 ±3.71## 39.60 ±5.76## 10.60 ±1.83 9.40 ±1.43## 8.80 ±1.62##鹽酸文拉法辛組 12.5/(mg/kg) 58.10 ±3.63 38.60 ±4.43## 55.00 ±4.06#△△ 11.30 ±2.79 9.10 ±1.79## 11.80 ±1.75△△四逆湯低劑量組 5.0 55.40 ±5.68 39.50 ±2.51## 44.80 ±3.91##△ 11.60 ±2.69 9.60 ±1.40## 10.60 ±1.55##△四逆湯高劑量組 10.0 57.00 ±4.47 39.00 ±3.30## 53.70 ±5.64##△△ 11.80 ±2.04 9.20 ±1.32## 11.10 ±1.91△△

3.3 各組大鼠海馬中樞神經(jīng)遞質的含量比較 見表4。

表4 各組大鼠海馬中神經(jīng)遞質的含量變化(±s，n=10)ng/g

注:與正常組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01;與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

5-HT DA NE正常組 — 12.16±2.28 4.96±1.12 36.26±6.51組 別 劑量/(g/kg)模型組 — 7.76±3.19## 2.16±0.87## 16.91±4.88##鹽酸文拉法辛組 12.5/(mg/kg) 11.27±2.16△△ 4.52±0.36△△ 32.34±5.26△△四逆湯低劑量組 5.0 8.78±1.21#△ 3.01±0.16#△ 25.31±6.21#△四逆湯高劑量組 10.0 10.54±2.12##△ 4.36±1.13△△ 30.40±5.91△△

4 討論

四逆散是調和肝脾的代表方，具有透邪解郁、疏肝理脾之功效。方中柴胡入肝膽經(jīng)，疏肝解郁、透邪外出為君藥;白芍斂陰養(yǎng)血柔肝，配合柴胡以補養(yǎng)肝血，條達肝氣為臣藥;佐以枳實理氣解郁，與柴胡為伍，一升一降，加強疏暢氣機之功，并奏升清降濁之效;使以甘草調和諸藥，益脾和中。諸藥共奏透邪解郁、疏肝理脾之效，使邪祛郁解，氣血調暢，清陽得伸。

研究［8］認為，抑郁癥的發(fā)生與腦中5-HT、NE和DA含量下降密切相關。抗抑郁藥如單胺氧化酶抑制藥和三環(huán)類抗抑郁藥等均可提高5-HT、DA和NE的含量達到抗抑郁的效果。有研究［9］表明，機體中樞內NE能神經(jīng)元系統(tǒng)與5-HT能神經(jīng)元系統(tǒng)在調節(jié)機體機能活動中常呈現(xiàn)對立統(tǒng)一關系。5-HT對中樞以抑制為主，NE則以興奮為主，兩者含量改變則分別引起情緒激動、急躁易怒與情緒低沉、抑郁寡歡。腦內的DA既是NE的前體，又是一種獨立的神經(jīng)遞質，在結構和功能上與NE有密切聯(lián)系，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要起著調控情緒的作用。因此，大鼠長期接受慢性應激刺激，下丘腦中的神經(jīng)遞質5-HT含量增加，而NE和DA的含量降低。實驗結果表明，四逆散可以顯著增加大鼠體質量，提高大鼠對蔗糖水的偏嗜度、Open-field實驗中的水平得分和垂直得分，說明四逆散有良好的抗抑郁作用。該方能對抗應激所造成的抑郁模型大鼠下丘腦中的5-HT、DA和NE的含量下降，說明模型組大鼠下丘腦中神經(jīng)遞質含量不足，而四逆散可以明顯提高神經(jīng)遞質含量。因此，筆者推測四逆散可能是通過增加下丘腦總神經(jīng)遞質的含量來達到抗抑郁作用。

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Effect ofSini Powderon behavior and neurotransmitter of rat with chronic stress-induced depression

LI Ming，XU Xiangdong*
(The Affiliated Hospital to Shandong University of TCM，Jinan 250011，China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effect ofSini Powderon behavior and neurotransmitter of rat with chronic stressinduced depression.MethodsChronic unpredictable mild stress was used to establish the rat depression model.50 male SD rats were divided randomly into five groups:the normal group，the model group，the venlafaxine(12.5 mg/kg)group and theSini Powder(10，5 g/kg)group.They were orally administered with drugs for three weeks.The sucrose preference test and the open-field test were assayed to detect animal behavior.The contents of 5-hydroxytryptamine(5-HT)、Norepinephrine(NE)and dopamine(DA)by fluorospentrophotometry were tested to clarify the anti-depression effect and mechanism of theSini Powder.ResultsCompared with the normal group，the rats of model group'weight，sugar water consumption，the open-field's score and the content of hypothalamus'neurotransmitter are lower.Compared with the model group，Sini Powderhigh and low dose group could significantly increase the rats'weight，sugar water consumption，the open-field's score and the content of hypothalamus'neurotransmitter.ConclusionSini Powdercan obviously improve depressive state of the rats and conduct the anti-depression.Its mechanism may be related with adjusting the content of neurotransmitter in hypothalamus.

Key words:Sini Powder;hypothalamus;5-HT;norepinephrine;dopamine

R285.5

A

2095－6258(2014)04－0579－04

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.04.006

山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃項目(2011-75)。

李 明(1971－)，男，大學本科，主管藥師。研究方向:中藥藥理研究。

徐向東，碩士，副主任藥師，電話:13793188391，電子信箱:zhengsanxiasd@126.com。

(

2014－04－04)