王永生，遲 航，徐 陽，羅 陽，曲曉波*

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春130117;2.吉林大學(xué)，長春130021)

RP-HPLC法測定哈蟆油中膽固醇棕櫚酸酯含量

王永生1，2，遲 航1，徐 陽2，羅 陽1，曲曉波1*

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春130117;2.吉林大學(xué)，長春130021)

目的 運(yùn)用RP-HPLC法測定哈蟆油中膽固醇棕櫚酸酯的含量。方法 使用Agilent zorbax-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);流動(dòng)相∶甲醇-水(79∶21);柱溫:30℃;體積流速:1.5 mL/min;檢測波長:210 nm;進(jìn)樣量均為10 μL。結(jié)果 哈蟆油中膽固醇棕櫚酸酯進(jìn)樣量在0.188 4～0.502 4 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均回收率為100.61%，RSD值為1.01%，且重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性均良好。結(jié)論 此方法可以通過RP-HPLC法快速、穩(wěn)定、精密的測定哈蟆油中膽固醇棕櫚酸酯的含量，減少以往利用正相色譜的不便。

哈蟆油;RP-HPLC法;膽固醇棕櫚酸酯;含量測定

哈蟆油，又名雪蛤油，哈士蟆油等，始載于明代《本草綱目》，具有補(bǔ)腎益精，養(yǎng)陰潤肺的功效，是我國一種名貴的動(dòng)物藥材，有極高的營養(yǎng)保健價(jià)值。哈蟆油中有一半以上為蛋白質(zhì)、氨基酸類，更含有不飽和脂肪酸、激素、磷脂類、核酸類、固醇類、酰胺類、維生素、糖類和微量元素等［1-7］。哈蟆油中膽固醇棕櫚酸酯為哈蟆油滋陰壯陽的主要藥效成分［8-11］，本文擬利用RP-HPLC法對(duì)哈蟆油的主要有效成分膽固醇棕櫚酸酯進(jìn)行含量測定，建立新的哈蟆油質(zhì)量測定方法。

1 材料

儀器:安捷倫1260型液相色譜儀(美國安捷倫有限公司);AVW20D型電子天平(日本島津制作所);RE 52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);KQ-400KDE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。試藥:膽固醇棕櫚酸酯對(duì)照品(自制，純度99%以上);甲醇為色譜純級(jí)，石油醚為分析級(jí)，水為娃哈哈純凈水。樣品:哈蟆油(Ranae oviductus)，購于2012年12月，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)姜大成教授鑒定為蛙科動(dòng)物中國林蛙的輸卵管干制品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜柱:Agilent zorbax C18柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流動(dòng)相∶甲醇-水(79∶21);柱溫:30℃;體積流速:1.5 mL/min;檢測波長為210 nm;進(jìn)樣量均為10 μL。理論塔板數(shù)按膽固醇棕櫚酸酯計(jì)算均不低于2 000。在此條件下，膽固醇棕櫚酸酯與其他物質(zhì)分離度均符合藥典規(guī)定。

2.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取膽固醇棕櫚酸酯3.14 mg，置100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制備成0.031 4 mg/mL的膽固醇棕櫚酸酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.3 供試品溶液的配制 哈蟆油粉碎，過60目篩，精密稱定1 g，加100 mL的石油醚超聲提取約20 min，過濾，在藥渣中加入100 mL石油醚超聲提取約30 min，過濾，并用100 mL石油醚洗滌藥渣，合并石油醚提取液，蒸干，用色譜甲醇溶解并用定容于10 mL容量瓶中。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液6，8，10，12，14，16 μL，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜峰面積。以色譜峰面積(Y)對(duì)溶液濃度(X)作圖，得到膽固醇棕櫚酸酯的回歸方程為Y=5.737 1X－9.241 9，r=0.999 8(n=6)，表明膽固醇棕櫚酸酯進(jìn)樣量在0.188 4～0.502 4 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)入高效液相色譜儀6次，測得膽固醇棕櫚酸酯色譜峰面積的RSD值分別為1.85%和1.48%，結(jié)果表明此方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性考察 精密吸取哈蟆油樣品(批號(hào)為20121201)制備的供試品溶液 10 μL，分別在 0，2，4，6，8，10，12，24 h 時(shí)，依次進(jìn)樣，測得膽固醇棕櫚酸酯色譜峰面積的RSD值為1.75%(n=8)，結(jié)果表明供試品溶液中膽固醇棕櫚酸酯在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取哈蟆油樣品(批號(hào):20121201)6分，每分約1 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，依法進(jìn)行含量測定，測得膽固醇棕櫚酸酯色譜峰面積，并計(jì)算出其含量的RSD值為1.65%，結(jié)果表明此方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取膽固醇棕櫚酸酯對(duì)照品6分，每分約15 mg，定容至10 mL容量瓶中，吸取1 mL，分別加入6分約0.5 g的哈蟆油樣品(批號(hào):20121201)與10 mL容量瓶中。按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，并進(jìn)行含量測定，計(jì)算回收率。結(jié)果膽固醇棕櫚酸酯的平均回收率為100.61%，RSD值為1.01%(n=6)，表明此方法回收率良好。

2.9 樣品測定 取不同產(chǎn)地哈蟆油樣品，按照制備供試品方法制備，分別精密吸取對(duì)照品和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀器中，依法進(jìn)行含量測定，記錄色譜峰面積，并按照外標(biāo)法計(jì)算供試品溶液中膽固醇棕櫚酸酯的含量，結(jié)果見表1。

表1 不同產(chǎn)地哈蟆油中膽固醇棕櫚酸酯的含量

3 小結(jié)

3.1 提取方法的考察 通過查閱文獻(xiàn)，選擇對(duì)比回流提取和超聲提取方法，發(fā)現(xiàn)回流提取樣品中膽固醇棕櫚酸酯含量較低，并雜質(zhì)成分有所增加，故選用超聲波提取法進(jìn)行提取。

3.2 流動(dòng)相的考察 通過選擇不同比例的乙腈與水(95∶5～85∶15)、甲醇與水(95∶5～75∶25)作為流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，甲醇與水(79∶21)可以將膽固醇棕櫚酸酯和雜質(zhì)很好的分離，且保留時(shí)間適中，峰形良好。

3.3 檢測波長的考察 因哈蟆油中成分較為復(fù)雜，不同成分的吸收不同，故在實(shí)驗(yàn)過程中以考察多種波長下的主峰與雜質(zhì)的分離度進(jìn)行篩選其檢測波長，至能準(zhǔn)確的計(jì)算膽固醇棕櫚酸酯的含量。膽固醇棕櫚酸酯為低波長吸收，過低波長可能影響基線平衡，故選擇210 nm為測定波長。

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［1］范玉林，崔香順，姚玉霞，等.哈士蟆油成分研究的進(jìn)展［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，18(3):109-115.

［2］胡鑫，劉成柏，陳曉平，等.林蛙油中主要營養(yǎng)保健成分含量的研究［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，25(2):218-220.

［3］王麗蘭，楊鳳和，王春霖，等.哈蟆油核酸含量分析［J］.中草藥，1990，21(12):21-23.

［4］趙文英，侯振榮，孫國忱.哈蟆油的研究進(jìn)展［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，13(1):68-72.

［5］王永生，姜大成，王恩思.哈蟆油脂溶性化學(xué)成分的研究［J］.中成藥，2006，28(1):93-94.

［6］林紀(jì)嫻，廖靜華，于中澤.中國林蛙與中華大蟾蜍輸卵管幾種脂溶性維生素的比較分析［J］.中藥材，1991，14(12):11-12.

［7］于洋，姜大成，張煒煜.哈蟆油對(duì)免疫力低下小鼠體內(nèi)脂肪酸含量的影響［J］.長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，24(2):150-151.

［8］衛(wèi)功慶，張愛武，蘇鳳燕，等.哈士蟆油與青蛙油脂肪酸及膽固醇的比較研究［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，21(S1):39-41.

［9］王永生，趙曉歐，白雪潔，等.哈蟆油薄層色譜指紋圖譜研究［J］.特產(chǎn)研究，2009(3):31-33，36.

［10］曲曉波，張煒煜.正確認(rèn)識(shí)哈蟆油的價(jià)值［N］.中國中醫(yī)藥報(bào)，2012-11-02(7)，2014-05-27.

［11］王永生，姜大成，孟勤，等.HPLC測定哈蟆油中十六烷酸膽甾醇酯含量研究［J］.中國中藥雜志，2005，30(13):990-991.

Determination of cholesterol palmitate in oviductus ranae by RP-HPLC

WANG Yongsheng1，2，CHI Hang1，XU Yang2，LUO Yang1，QU Xiaobo1*
(1.Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，China;2.Jilin University，Changchun 130021，China)

Abstract:ObjectiveTo determine the contents of Cholesterol palmitate in Oviductus Ranae by RP-HPLC.MethodsThe chromatographic column:Agilent zorbax-C18(4.6 × 150 mm，5 μm);The mobile phase:methanol-water(79:21);The column temperature:30 ℃;The volumetric flow rate:1.5 mL/min;The UV detector was set at 210 nm;The sample size:10 μL.ResultsCholesterol palmitate showed good liner relation when the content was during 0.188 4 ～0.502 4 μg in the samples，the average recovery was 100.61%，RSD=1.01%，good stability，precision and repeatability;ConclusionThis method can determine the contents of Cholesterol palmitate in Ranae Oviductus，it is fast，accurate and stable and reduce the use of normal phase chromatography inconvenience in the past.

Key words:ranae oviductus;RP-HPLC;cholesterol palmitate;content determination

R284.1

A

2095－6258(2014)04－0604－03

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.04.015

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAI03B07)。

王永生，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師。研究方向:中藥有效成分研究。

曲曉波，女，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，電話:0431-86172508，電子信箱:quxiaobo0504@hotmail.com。

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2014－05－27)