楊佃會(huì)，馬祖彬，韓 晶，陳新勇

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南250355;2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟(jì)南250011;3.單秋華全國(guó)名老中醫(yī)藥專家傳承工作室，濟(jì)南250011)

耳緣靜脈放血對(duì)偏頭痛家兔模型的鎮(zhèn)痛效應(yīng)及中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)c-fos表達(dá)的影響

楊佃會(huì)1，2，3，馬祖彬2，3，韓 晶2，3，陳新勇2，3

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南250355;2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟(jì)南250011;3.單秋華全國(guó)名老中醫(yī)藥專家傳承工作室，濟(jì)南250011)

目的 觀察耳緣靜脈放血對(duì)偏頭痛家兔模型的鎮(zhèn)痛效應(yīng)及對(duì)中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)(PAG)c-fos的表達(dá)，從而揭示耳緣靜脈放血的鎮(zhèn)痛作用機(jī)制。方法 30只新西蘭家兔按隨機(jī)數(shù)字表分為耳緣靜脈放血組、模型組和空白組。按5 mg/kg標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)3 d頸后皮下注射硝酸甘油復(fù)制偏頭痛家兔模型，在第3天造模60 min后耳緣靜脈放血，分別在造模前、造模30 min和放血后即刻進(jìn)行痛閾測(cè)定。免疫組化法觀察偏頭痛家兔模型PAG區(qū)c-fos表達(dá)。結(jié)果 痛閾改變:造模30 min耳緣靜脈放血組和模型組的痛閾明顯降低，與造模前比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，與空白組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);耳緣靜脈放血組放血后即刻痛閾明顯升高，與造模30 min比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);耳緣靜脈放血組家兔模型PAG區(qū)c-fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯降低，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論 耳緣靜脈放血有明顯的鎮(zhèn)痛作用，通過(guò)抑制偏頭痛家兔模型PAG區(qū)c-fos基因表達(dá)發(fā)揮了鎮(zhèn)痛效應(yīng)。

耳緣靜脈放血;偏頭痛;家兔模型;c-fos;痛閾測(cè)定

筆者既往臨床觀察耳穴綜合療法治療偏頭痛療效顯著［1］，并對(duì)外周神經(jīng)遞質(zhì)的作用機(jī)制也進(jìn)行了初步探討［2-4］。耳背靜脈放血為關(guān)鍵技術(shù)，能夠明顯降低中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)PAG區(qū)G蛋白含量［5］，而對(duì)PAG區(qū)c-fos蛋白的影響尚不清楚，探討對(duì)PAG區(qū)c-fos蛋白的表達(dá)進(jìn)一步揭示耳緣靜脈放血的中樞鎮(zhèn)痛機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康純種新西蘭家兔30只，體質(zhì)量1.5～2.5 kg，雌雄各半，由濟(jì)南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(魯)20090013。將30只純種新西蘭家兔按隨機(jī)數(shù)字表法分為耳緣靜脈放血組、模型組和空白組，每組10只，雌雄各半。2)主要試劑和儀器:硝酸甘油注射液(5 mg/1 mL，北京益民藥業(yè)有限公司，批號(hào)20111202)，c-fosAntibody(S-045-50，0.05 mg，購(gòu)自濟(jì)南美斯泰商貿(mào)發(fā)展有限公司，Novus生產(chǎn))，免疫組化染色試劑盒(PV-9003，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，DAB試劑盒(ZLI-9018，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。組織脫水機(jī)(ASP300S，LEICA)，石蠟包埋機(jī)(EG1150H，LEICA)，生物組織攤烤片機(jī)(YT-7FB，亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司)，顯微鏡(BX51，OLYMPUS)，丹吉爾數(shù)字醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(DEIAS-2000P/C/E/U，濟(jì)南丹吉爾電子有限公司)，WQ-9E測(cè)痛儀(北京海淀區(qū)電子儀器廠生產(chǎn))。

1.2 模型制備 參照經(jīng)典硝酸甘油造模法，按5 mg/kg標(biāo)準(zhǔn)頸后皮下注射硝酸甘油造模。造模1次/d，分別在第3天造模前、造模30、60 min后進(jìn)行痛閾測(cè)定。痛閾測(cè)定法:采用鉀離子透入法。安靜環(huán)境中，將家兔固定在固定器中，先用脫毛劑脫去兩側(cè)耳朵毛，在家兔一側(cè)耳表面安裝含有飽和氯化鉀溶液的電極，無(wú)關(guān)電極接在另一側(cè)耳，兩個(gè)電極與QW-9E測(cè)痛儀相連，用電流強(qiáng)度線型遞增的直流電將K+導(dǎo)入皮膚做痛刺激。選用階梯輸出，電流強(qiáng)度0～10 mA，階寬1 s，階高0.1 mA。以家兔頭部開(kāi)始出現(xiàn)掙扎反應(yīng)作為疼痛指標(biāo)，經(jīng)引起家兔掙扎反應(yīng)的最小電流強(qiáng)度作為痛閾，共測(cè)3次，每次間隔5 min，取其平均值作為痛閾。

1.3 治療方法 耳緣靜脈放血組第3天造模30 min后耳緣靜脈放血1次。用75%的乙醇棉球在耳緣靜脈處進(jìn)行局部消毒，實(shí)驗(yàn)者以一手固定住家兔的耳朵，另一手持一次性注射針頭于耳緣靜脈遠(yuǎn)心端快速點(diǎn)刺使之出血，雙側(cè)耳緣靜脈可出血約2～3 mL。放血后30 min進(jìn)行痛閾測(cè)定。

1.4 標(biāo)本處理 用戊巴比妥鈉按30 mg/kg標(biāo)準(zhǔn)耳緣靜脈注射麻醉，麻醉成功后，仰臥固定，開(kāi)胸，左心室插管，剪開(kāi)右心耳，先迅速灌注生理鹽水，至家兔肝臟及腸系膜變蒼白后，再灌注4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液500 mL，以固定標(biāo)本。灌注結(jié)束后，打開(kāi)顱腔將全腦取出，置于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中后固定，并標(biāo)號(hào)。參照Sawyer氏圖譜定位，切取中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)區(qū)脫水、包蠟。對(duì)PAG區(qū)作連續(xù)冠狀切片，每張片厚3 μm，腦切片每隔5張留取一張，共選取5張切片。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 3%H2O2去離子水孵育10 min;蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min×3次;滴加1∶150稀釋的一抗，37℃孵育1 h;PBS沖洗，3 min×3次;滴加試劑1，37℃孵育20 min;PBS沖洗，3 min×3次;滴加試劑2，37℃孵育20 min;PBS沖洗，3 min×3次。將玻片甩干后，滴加DAB顯色劑，顯色2 min。自來(lái)水充分沖洗。復(fù)染，脫水，透明，封片。陰性對(duì)照組以PBS代替一抗。

1.6 圖像分析 c-fos免疫組化染色，鏡下可見(jiàn)背景為米白色，c-fos免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元呈黃褐色，以核染為主。光鏡下觀察每張切片的中央、左上、左下、右上、右下5個(gè)高倍視野的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)之和。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)用SPSS 17.0 for windows軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用方差分析，組間比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 3組偏頭痛家兔模型痛閾改變情況比較 見(jiàn)表1。

表1 3組偏頭痛家兔模型痛閾改變情況比較(±s，n=10)mA

表1 3組偏頭痛家兔模型痛閾改變情況比較(±s，n=10)mA

注:與造模前比較，##P＜0.01;與造模 30 min比較，△△P＜0.01;與空白組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01;與模型組比較，★P＜0.05

組 別 造模前 造模后30 min 造模后60 min空白組 7.82±1.35 7.42±1.76 7.47±1.39模型組 8.11±0.75 4.29±1.09##▲▲3.66±1.12▲▲耳緣靜脈放血組 7.91±1.49 4.06±1.05##▲▲5.92±1.65△△▲★

2.2 3組偏頭痛家兔模型PAG區(qū)c-fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較 見(jiàn)表2。

表2 3組偏頭痛家兔模型PAG區(qū)c-fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(±s，n=10)

表2 3組偏頭痛家兔模型PAG區(qū)c-fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(±s，n=10)

注:與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01;與模型組比較，△△P＜0.01

組 別 c-fos 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)空白組 61.70±13.99模型組 301.40±33.43##耳緣靜脈放血組 155.20±27.66#△△

3 討論

耳穴治療偏頭痛歷史悠久，早在《靈樞·厥病》中有耳背放血治療頭痛的記載:“頭痛甚，耳前后動(dòng)脈涌有熱，瀉出其血?！薄鹅`樞·口問(wèn)》曰:“耳者，宗脈之所聚也?！闭f(shuō)明經(jīng)絡(luò)與耳有十分密切的聯(lián)系。偏頭痛發(fā)病日久，瘀血阻絡(luò)是一個(gè)重要證型［6］，活血化瘀為內(nèi)治大法［7-8］，而采用耳背靜脈放血法切中病機(jī)。同時(shí)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)也證實(shí)了耳廓有來(lái)自諸如耳大神經(jīng)、枕小神經(jīng)、耳顳神經(jīng)、面神經(jīng)、舌咽神經(jīng)、迷走神經(jīng)的分支及交感神經(jīng)等。刺激耳廓某些特定部位，可以促進(jìn)腦組織乳酸堆積的清除、抑制自由基反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)腦內(nèi)興奮性氨基酸遞質(zhì)代謝，減輕神經(jīng)元細(xì)胞損傷的作用［9］，通過(guò)神經(jīng)體液途徑，調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)［10］，起到通調(diào)氣血，祛邪止痛作用［11］。

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)c-fos基因參與重要腦功能活動(dòng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控過(guò)程。硝酸甘油模型引起三叉神經(jīng)纖維的超敏性，引發(fā)頭痛，可引起c-fos在三叉神經(jīng)脊束背核尾側(cè)亞核(TNC)內(nèi)相似區(qū)域的快速表達(dá)［12-16］。有研究［17］表明鼻療法噴霧劑能治療偏頭痛的作用機(jī)制是控制中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)c-fos蛋白的表達(dá)。本研究結(jié)果耳緣靜脈放血能明顯升高偏頭痛家兔模型的痛閾(P＜0.01)，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說(shuō)明耳緣靜脈放血能明顯升高偏頭痛家兔模型痛閾，起到明顯的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，其作用機(jī)制是通過(guò)抑制PAG區(qū)c-fos基因的異常表達(dá)來(lái)參與鎮(zhèn)痛效應(yīng)。

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C-fos expression in PAG area of ear-edge vein bloodletting on rabbit models of migraine

YANG Dianhui1，2，3，MA Zubin2，3，HAN Jing2，3，CHEN Xinyong2，3
(1.Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China;2.Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250011，China;3.Famous Traditional Chinese Medical Doctor Shan Qiuhua's Inheritance Studio，Jinan 250011，China)

Abstract:ObjectiveTo observe the analgesic effect of ear-edge vein bloodletting on rabbit and the influence of c-fos expression in the periaqueductal gray(PAG)area.Consequently，reveal the analgesic mechanism of marginal vein bloodletting ears.Methods30 New Zealand rabbits were randomly divided into 3 groups，ear-edge vein bloodletting group，model group and blank group.By subcutaneous injection nitroglycerin in the rabbits'neck according to the standard of 5 mg/kg for 3 day，the migraine models were successfully copied.The ear-edge vein blood were ensanguined after 60 minutes of molding，pain threshold was determined in front of the building，building immediately after 30 min and bleed.Then we observed the expression of c-fos in PAG of rabbits by immunohistochemical method after the end of the course.ResultsThe change of pain threshold:the pain threshold of ear-edge vein bloodletting group and model group were significantly reduced，compared with before building has a very significant difference(P ＜0.01)，and compared with blank group has a very significant difference(P ＜0.01);the immediate pain threshold of ear-edge vein bloodletting group was increased significantly，compared with after 30 minutes of molding has a very significant difference(P ＜0.01)，and compared with model group has a very significant difference(P ＜0.01);positive cells in the PAG area c-fos of ear-edge vein bloodletting group were significantly decreased，compared with model group(P ＜0.01).ConclusionThe therapy of ear-edge vein bloodletting has analgesic effect，which can decrease the expression of c-fos gene in PAG of rabbit models of migraine.

Key words:ear-edge vein bloodletting;migraine;rabbit model;c-fos;pain threshold determination

R285.5

A

2095－6258(2014)04－0576－03

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.04.005

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目“耳緣靜脈放血對(duì)偏頭痛家兔模型鎮(zhèn)痛調(diào)控機(jī)制的研究”(ZR2009CM058)。

楊佃會(huì)(1966－)，男，醫(yī)學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師。研究方向:耳穴綜合療法治療偏頭痛。

(

2014－04－02)