蔡家利，尹忠寶，朱廣倍，任燕斌，吳勝昔，黃國光

(重慶理工大學藥學與生物工程學院，重慶 400054)

豬病毒病一直是阻礙養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的一大因素［1］，我國每年因豬的病毒性疾病造成的經濟損失達數十億元。對于豬的病毒性傳染病(如豬瘟、口蹄疫、豬繁殖與呼吸綜合征等)，目前主要靠疫苗進行預防。隨著對抗病毒藥物的管理愈加嚴格，動物的病毒性傳染病的治療只有依靠高免血清或病毒干擾制劑，因此，動物病毒病愈加需要更經濟、安全、有效的藥物。干擾素是由機體細胞產生的一類高活性多功能糖蛋白，具有廣譜抗病毒、抗腫瘤活性及免疫調節(jié)等多種功能，其中又以α－干擾素的廣譜抗病毒作用最為顯著。利用基因工程技術獲得的具有生物學活性的重組豬α－干擾素對豬病毒感染的防治具有重要的意義［2］。

筆者所在實驗室在前期研究的基礎上，進行了干擾素的可溶性表達和純化工藝的研究，但需對產品活性高低和冷凍干燥方法進行研究。因此，本文旨在對該方法制備的干擾素進行體外活性測定和凍干保護劑的篩選，從而為干擾素注射劑的進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、毒株和細胞

大腸桿菌BL-21干擾素工程菌株、Marc-145細胞株均由重慶理工大學生物制藥實驗室保存，豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)毒株由南京農業(yè)大學饋贈。

1.1.2 主要試劑及材料

Ni-NTA Sefinose Resin填料購自生工生物工程有限公司;蛋白Marker和牛血清白蛋白購自鼎國昌盛生物技術公司;四季青無支原體新生牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司;甘露醇為溫州市東升化工試劑廠產品。

1.1.3 儀器

LaboGene冷凍干燥機，型號:Coolsafe 110-4;全自動凝膠成像系統，型號:Gel Doc EZ，廠家:美國伯樂公司。

1.1.4 凍干保護劑的含量

選擇甘露醇和牛血清白蛋白作為保護劑，含量分別為1%，3%，5%。

1.2 樣品制備

重組豬α干擾素按照本實驗室已建立的誘導表達，采用純化工藝進行制備［3］。取保存的干擾素工程菌株，接種到含氨芐青霉素(Amp)100 μg/mL的固體LB平板，分離單菌落。挑取單一菌落接種到50 mL含Amp(100 μg/mL)的液體LB培養(yǎng)基，37℃、200 r/min過夜培養(yǎng)。將菌液按體積比1∶100的比例接種到2 L含Amp(100 μg/mL)的液體LB培養(yǎng)基，37℃、200 r/min培養(yǎng)至 OD600為0.6～0.8時，加入終濃度為0.5 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，20℃、120 r/min誘導10 h。收集菌液，5000 r/min離心收集菌體，稱重，按10 mL/g菌體加入裂解液使其重懸，超聲破菌。破菌液10000 r/min離心收集上清液。用0.45 μm濾膜過濾一次，上樣到已平衡好的Ni-NTA親和層析柱，收集穿透液。用平衡buffer平衡柱子收集平衡液，再用20 mmol/L，200 mmol/L咪唑洗脫，用SDS-PAGE分析純化效果。洗脫液用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)透析，所得即為干擾素原料。

1.3 PRRSV 的擴增

按常規(guī)方法培養(yǎng)Marc-145細胞，至細胞長成單層。棄去細胞培養(yǎng)中的瓶上清液，用PBS(0.01 mol/L)清洗2次。加入1mL提前融化的毒種，37℃吸附1 h，每15 min搖勻一次。棄去病毒液，加入5 mL含2%小牛血清的DMEM維持液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察細胞病變情況，當80%細胞產生病變時，反復凍融3～4次，吹散并分裝到無菌Eppendorf離心管中，－80℃保存。

1.4 PRRSV的細胞培養(yǎng)半數感染量 CCID50測定

將細胞消化成單個細胞，加10%完全培養(yǎng)基吹打成細胞懸液。計數并稀釋至每毫升含105個細胞。以每孔100 μL懸液接種到96孔板，邊緣孔各加100 μL無菌水或PBS。待細胞長滿孔底，棄去上清，用PBS洗去殘余血清，2號列加入無血清培養(yǎng)基，3～11列分別加入10倍系列稀釋的病毒液。37℃吸附1h，棄去上清，每孔加入100 μL維持液。37℃培養(yǎng)觀察，當最高濃度孔細胞80%以上發(fā)生病變時，讀取每個稀釋度發(fā)生病變的孔數并做記錄，按Reed-Muench法［4］計算公式計算病毒 CCID50。

1.5 干擾素活性測定［5］

保存的干擾素用含7%血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋至31.84 μg/mL，并做4倍系列稀釋，共7個稀釋度。取病毒液，稀釋至100倍CCID50。96孔板培養(yǎng)細胞同上。將孔板按以下程序進行實驗:棄去上清，每孔加梯度稀釋的干擾素100 μL作用18 h，然后洗去殘余血清，每孔加100 μL病毒稀釋液攻毒1 h，換維持液，37℃培養(yǎng)觀察。96孔板布局如下(邊緣孔加無菌水):2號列做空白對照;3號列為干擾素組，不加病毒;4號列為病毒組，不加干擾素;5～11列為實驗組。72 h后讀取每個稀釋度發(fā)生病變的孔數并做記錄，按Reed-Muench法計算干擾素活性。

1.6 凍干保護劑的篩選

1.6.1 分裝

按照配方配制干擾素溶液，在潔凈層流局部100級超凈臺中，用0.22 μm濾膜除菌過濾，分裝在潔凈的青霉素瓶中，每瓶分裝4 mL。

1.6.2 凍干

－80℃預凍3 h，放入已調試好的凍干機中進行凍干。48 h后取出樣品，－20℃保存。

1.6.3 凍干成品測定

①外觀檢查:應為白色疏松體，骨架成型好;② 體外活性測定:凍干成品溶解后，按照1.5節(jié)方案進行活性測定。

2 實驗結果

2.1 干擾素的制備

SDS-PAGE電泳膠經凝膠成像系統掃描，干擾素條帶位置與前期研究結果一致(圖1)。干擾素在200 mmol洗脫液中純度可達到90%以上。通過Bradford法測定，200 mmol洗脫液中蛋白濃度為3.79 mg/mL，干擾素表達量達到每升菌液121.28 mg，占菌體總蛋白的30%以上，實現了干擾素的高效表達。

2.2 PRRSV 增殖

細胞在接種病毒后發(fā)生皺縮，形成網狀隆起且病變逐漸增多，如圖2所示。

2.3 PRRSV 的 CCID50的測定

PRRSV感染Marc-145細胞的情況(見表1)，細胞對照組均無細胞病變。計算得增殖的PRRSV的 CCID50為10－5.5/0.1 mL。利用 Marc －145 細胞成功獲得了高滴度的PRRSV。

圖1 干擾素蛋白SDS-PAGE電泳

圖2 接種病毒后與正常細胞對比

表1 PRRSV感染Marc－145細胞觀察結果

2.4 重組豬IFN-α活性測定

記錄重組豬α干擾素對Marc-145細胞病變保護的結果如表2所示。按Reed-Muench法計算干擾素的比活性為4.41×105U/mg，細胞對照組均未發(fā)生病變，病毒對照組均出現病變，達到了《中華人民共和國獸用生物制品質量標準》的要求。

表2 重組豬α干擾素對Marc-145細胞病變保護的結果

2.5 凍干保護劑篩選

2.5.1 外觀檢查

含1%、3%、5%的甘露醇樣品，表面平整，均勻一致，與空白組沒有明顯區(qū)別;含3%和5%白蛋白的樣品在同樣的條件下出現萎縮;含1%白蛋白的樣品稍微離壁。根據凍干產品的外觀要求，含3%和5%白蛋白的樣品不再進行活性測定。

2.5.2 體外活性測定

經過活性測定，3種含量的甘露醇保護率均在90%以上，而3%甘露醇的保護率最高。1%白蛋白對干擾素的保護率僅有73.47%，故選擇3%甘露醇作為凍干保護劑(表3)。

表3 凍干保護劑篩選

3 討論與結論

目前干擾素活性測定的規(guī)定方法是采用WISH/VSV系統進行細胞病變抑制法實驗，但也有研究采用 Marc-145/PRRSV系統進行實驗［6］。本研究選擇Marc-145/PRRSV系統進行活性測定更具有針對性。

對于凍干保護劑的選擇，應力求成本低、無污染、配方簡單［8］。血清白蛋白是經典的凍干保護劑，雖然血液制品的安全性一直限制著血清白蛋白的應用［9］，但仍有一些產品使用血清白蛋白作為凍干保護劑。甘露醇無吸濕性，干燥快，在凍干制品中既可以作為載體又可以作為賦形劑，同時價格低廉，生物相容性好。經過對比性實驗，發(fā)現甘露醇對干擾素凍干保護效率較高，因此選擇甘露醇作為凍干保護劑。對于凍干工藝的研究，是下一步研究要解決的問題。

本研究中，干擾素蛋白為可溶性表達，可以在實現高效表達的同時具有較強的活性，一步純化即可獲得較高純度的產品。經保護率測定，用3%甘露醇作為保護劑可以有效保護蛋白活性免受冷凍干燥的影響，對豬α干擾素凍干粉針劑型的進一步研究具有很重要的意義。

［1］Susan L，Brockmeier，Crystal L L.The Presence of Alpha Interferon at the Time of Infection Alters the Innate and Adaptive Immune Responses to Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus［J］.Clinical and Vaccine Immunology，2012，19(4):508 －514.

［2］Robert M F.Antiviral Activity of Interferons［J］.Bacteriological Reviews.1977，41(3):543 －567.

［3］蔡家利，戶國達，孫加燕，等.重組豬IFN-α的構建及原核可溶性表達研究［J］.重慶理工大學學報:自然科學版，2013，27(2):23 －27.

［4］中華人民共和國農業(yè)部.中華人民共和國獸用生物制品質量標準(2001年)［M］.北京:中國農業(yè)科技出版社，2001:附錄314 －315.

［5］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典第三部(2010年)［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄 71－72.

［6］王彥彬，黃艷群，崔保安，等.豬α干擾素在桿狀病毒中表達及其對PRRSV的抑制作用［J］.中國獸醫(yī)學報，2009，29(12):1522 －1526.

［7］段博芳，沈艷萍，楊貴樹，等.PRRSV云南株的分離鑒定［J］.動物醫(yī)學進展，2010，31(4):11 －15.

［8］董世娟，朱于敏，于瑞嵩，等.重組豬干擾素凍干保護劑的篩選［J］.中國獸藥雜志，2010，44(3):37 －40.

［9］張代寶，吳志明，趙明軍，等.干擾素制劑凍干技術研究進展［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2012，39(8):57 －60.