劉亞麗

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

張凱敏 高彩球

(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué)))

光捕獲葉綠素a/b結(jié)合蛋白(LHCb)是光系統(tǒng)II(PSII)捕光復(fù)合物的脫輔基蛋白，通常與葉綠素和葉黃素形成捕光色素蛋白復(fù)合體[1]。作為捕光復(fù)合物的重要組成部分，PSII的外天線(xiàn)蛋白LHCBs是葉綠體類(lèi)囊體中含量最豐富的膜蛋白，行使光能傳遞、轉(zhuǎn)化和分配等功能，在植物光合作用中起到關(guān)鍵的作用。目前，已從多種植物中克隆獲得了LHCB 蛋白基因，如擬南芥[2]、水稻[3]、龍舌蘭[4]、菠菜[5]、甘蔗[6]等。研究表明 LHCB 基因的表達(dá)受多種逆境脅迫的調(diào)控，包括氧脅迫[7]、鹽脅迫[8]和激素信號(hào) ABA[7]等。

檉柳屬植物是一類(lèi)多年生灌木或小喬木，非?？购的望}堿。研究發(fā)現(xiàn)低質(zhì)量濃度(4 g/L)鹽水處理能促進(jìn)多枝檉柳的生長(zhǎng)和光合作用，只有在高質(zhì)量濃度(12～28 g/L)的鹽水處理后，產(chǎn)生鹽分脅迫，使其因氣孔因素限制而光合作用下降[9]。目前，關(guān)于逆境脅迫后檉柳的生理及光合變化研究比較多，但是關(guān)于其分子機(jī)制的研究比較少。對(duì)剛毛檉柳根部[10]和葉部[11]組織鹽脅迫不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)，分析結(jié)果表明剛毛檉柳耐鹽分子機(jī)制非常復(fù)雜，對(duì)鹽堿脅迫的響應(yīng)涉及多個(gè)生理和代謝途徑。其中一些光合相關(guān)基因也參與了檉柳的抗鹽脅迫，受鹽堿脅迫的誘導(dǎo)或抑制。本研究通過(guò)對(duì)0.3 mol/L NaHCO3脅迫處理0、12、24和48 h的剛毛檉柳根部組織和脅迫0、12、24 h葉部組織共7個(gè)轉(zhuǎn)錄組的序列進(jìn)行分析，查找獲得了一條葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因的全長(zhǎng)cDNA序列，進(jìn)一步對(duì)其在鹽脅迫處理后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)模式進(jìn)行分析。旨在為進(jìn)一步了解該基因在剛毛檉柳應(yīng)答鹽脅迫中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 剛毛檉柳的培養(yǎng)和脅迫處理

將剛毛檉柳種子播種于V(泥炭土)∶V(沙)=2∶1的混合土壤中，培養(yǎng)在平均溫度24℃、光照時(shí)間14 h/d、相對(duì)濕度70% ～75%溫室中。待生長(zhǎng)2個(gè)月后，進(jìn)行脅迫處理。

用于轉(zhuǎn)錄組cDNA文庫(kù)構(gòu)建的剛毛檉柳，采用0.3 mol/L NaHCO3溶液澆灌，分別在脅迫處理0、12、24和48 h后，取剛毛檉柳的葉部(地上部分)和根部(地下部分)組織用于剛毛檉柳轉(zhuǎn)錄組cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。

用于實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR分析的剛毛檉柳，分別澆灌水(對(duì)照)和0.4 mol/L NaCl溶液，于處理不同時(shí)間后收集剛毛檉柳的根部(地下部分)和葉部組織(地上部分)。NaCl處理的時(shí)間點(diǎn)包括3、6、9、12 和24 h 及 6 d 和 12 d，此外進(jìn)行了 NaCl溶液澆灌6 d后，再?gòu)?fù)水6 d處理(標(biāo)記為6 d+6 d)。每個(gè)樣品至少包括20棵苗木，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2 Thcab1基因的克隆與序列分析

對(duì)剛毛檉柳7個(gè)轉(zhuǎn)錄組的Unigenes進(jìn)行BLASTX和BLASTN分析，根據(jù)功能注釋結(jié)果查找獲得 Thcab1基因，用 ORF founder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf.html)程序確定其開(kāi)放讀碼框。用 ProtParam(http://au.expasy.org/tools/protparam.html)軟件計(jì)算推導(dǎo)的ThCabl蛋白質(zhì)的分子量及理論等電點(diǎn);利用 Target P1.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)預(yù)測(cè)蛋白亞細(xì)胞器定位;利用 BlastP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進(jìn)行序列同源性搜索;利用Clustal X1.83軟件對(duì)9種不同植物來(lái)源的cab1蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，并繪制分子進(jìn)化樹(shù)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR

CTAB法提取對(duì)照(非脅迫處理)和0.4 mol/L NaCl處理不同時(shí)間點(diǎn)的剛毛檉柳根和葉部組織的總RNA，經(jīng)DNase I(Promega)消化除去DNA，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)合成 cDNA。將合成后的第一鏈的cDNA稀釋10倍用于定量RTPCR分析。

實(shí)時(shí)定量RT－PCR使用試劑盒SYBR Green Realtime PCR Master mix(Toyobo)。內(nèi)參基因?yàn)閍lpha tublin(genebank NO.FJ618518)、Actin(genebank NO.FJ618517)和 beta tublin(genebank NO.FJ618519)，引物序列見(jiàn)表1。實(shí)時(shí)定量 RT－PCR反應(yīng)體系為:10 μL 2 ×SYBR premix Ex Taq酶、上下游引物(20 μmol/L)各 0.5 μL、2 μL 稀釋后的模板cDNA，加去離子水補(bǔ)足20 μL。qRT－PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性30 s;94℃變性15 s，61℃退火45 s，72 ℃ 延伸45 s;80.5 ℃ 讀板1 s，45 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次，用2－△△Ct方法進(jìn)行基因的相對(duì)定量分析[12]。

表1 實(shí)時(shí)定量RT－PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 Thcab1基因全長(zhǎng)cDNA的獲得及序列分析

通過(guò)對(duì)剛毛檉柳7個(gè)轉(zhuǎn)錄組序列的查找和分析，獲得了Thcab1基因的全長(zhǎng)cDNA序列。對(duì)Thcab1基因序列的ORF founder分析證實(shí)該基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)822 bp，編碼273個(gè)氨基酸。5’非翻譯區(qū)(UTR)137 bp，3’非翻譯區(qū)(UTR)334 bp(圖1)。

ProtParam預(yù)測(cè)該基因編碼蛋白質(zhì)的分子量為29.44 ku，理論等電點(diǎn)為 7.84。TargetP 預(yù)測(cè)表明該基因編碼的蛋白定位于葉綠體(圖2)。BLASTP對(duì)Thcab1蛋白保守區(qū)的預(yù)測(cè)結(jié)果表明該蛋白屬于光捕獲葉綠素a/b結(jié)合蛋白(圖3)。

通過(guò)BLASTP多序列比對(duì)，選擇與剛毛檉柳Thcab1蛋白序列相似程度高的8種其它植物的cab1蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)，這8種植物分別為木本植物梔子(Gardenia jasminoides)、毛果楊(Populus trichocarpa)和歐洲赤松(Pinus sylvestris);木質(zhì)藤本植物葡萄(Vitis vinifera)和草本植物番茄(Solanum lycopersicum)、忽地笑(Lycoris aurea)、大豆(Glycine max)和黃瓜(Cucumis sativus)。多序列比對(duì)結(jié)果表明:Thcab1蛋白與其它植物cab蛋白的氨基酸序列一致性在78%～88%，其中番茄和毛果楊最高為88%。進(jìn)化分析表明剛毛檉柳的Thcabl蛋白與番茄的進(jìn)化關(guān)系比較近(圖4)。

2.2 Thcab1基因表達(dá)模式分析

通過(guò)對(duì)NaHCO3脅迫后的剛毛檉柳7個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，無(wú)論根還是葉中，Thcab1基因的表達(dá)都表現(xiàn)為明顯受鹽脅迫抑制(表2)。表明Thcab1基因可能參與了剛毛檉柳的抗逆脅迫響應(yīng);同時(shí)，在非脅迫情況下，葉中的Thcab1基因的表達(dá)量是根中表達(dá)量的88.2倍，鹽脅迫24 h后，葉中的Thcab1基因的表達(dá)量是根中的172.3倍，表明Thcab1基因主要在葉中表達(dá)。為了進(jìn)一步分析Thcab1基因的鹽脅迫不同時(shí)間的應(yīng)答情況，采用實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR技術(shù)比較了鹽(0.4 mol/L NaCl)處理后8個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)剛毛檉柳Thcab1基因的表達(dá)模式(表3)。結(jié)果表明，在0.4 mol/L NaCl脅迫下，Thcab1基因無(wú)論在根還是葉中，都表現(xiàn)為短時(shí)間內(nèi)(24 h)受鹽脅迫的調(diào)控，而長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)量變化不大。脅迫后24 h內(nèi)，在根中主要表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，脅迫12 h表達(dá)量達(dá)到最高，被誘導(dǎo)了75.6倍。在葉中脅迫24 h表達(dá)量達(dá)到最大，表達(dá)量是非脅迫處理的35.3倍。

圖1 剛毛檉柳Thcab1基因的cDNA及由此推導(dǎo)的氨基酸序列

圖2 TargetP預(yù)測(cè)結(jié)果

圖3 剛毛檉柳Thcab1蛋白保守區(qū)預(yù)測(cè)

圖4 9種植物cab蛋白的多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析

3 結(jié)論與討論

LHCB基因表達(dá)的調(diào)控被認(rèn)為是植物調(diào)節(jié)葉綠體功能的重要機(jī)制之一[13]。先前的研究表明LHCB家族成員在植物適應(yīng)環(huán)境脅迫中起重要作用[14]，其表達(dá)受 ABA 信號(hào)調(diào)控[7]。耐鹽植物海蓬子在0.2 mol/L NaCl處理后，類(lèi)囊體膜上PSⅡ天線(xiàn)色素CP29蛋白和CP47蛋白以及位于PSⅡ和PSⅠ光捕獲系統(tǒng)上葉綠素a/b結(jié)合蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)[8]。

本研究中，通過(guò)對(duì)剛毛檉柳鹽堿脅迫后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)查找分析，克隆獲得一個(gè)LHCB基因，保守區(qū)預(yù)測(cè)和蛋白定位分析都表明該基因符合光捕獲葉綠素a/b結(jié)合蛋白特征。與其它植物L(fēng)HCB基因的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明這些植物的LHCB基因氨基酸序列一致性高達(dá)78%～88%。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明該基因的表達(dá)受鹽堿脅迫的抑制。定量數(shù)據(jù)表明高鹽(0.4 mol/L NaCl)脅迫后，在脅迫初期剛毛檉柳Thcab1基因的表達(dá)量受明顯的誘導(dǎo)，而隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，該基因的表達(dá)量與非脅迫處理間差異不明顯。張麗麗等[15]研究也表明，在耐鹽雜草稻(Oryza sativa L.f.spontanea)中，鋅指蛋白基因WR03－12中受鹽脅迫短時(shí)間誘導(dǎo)，長(zhǎng)時(shí)間(第7天)恢復(fù)到脅迫前水平，表明這些基因可能主要參與鹽脅迫初期的應(yīng)答。

表3 NaCl脅迫后Thcab1基因表達(dá)模式分析

在以往對(duì)剛毛檉柳的基因表達(dá)分析也表明NaCl和NaHCO3脅迫后基因的表達(dá)趨勢(shì)并不完全一致[11，16]。兩種脅迫后 Thcab1基因表達(dá)趨勢(shì)完全相反可能是由于堿性鹽(NaHCO3)對(duì)植物的影響不僅是產(chǎn)生鹽害(Na+)，同時(shí)由于其具有較高的pH值，高pH值強(qiáng)烈地影響了剛毛檉柳光合相關(guān)基因的表達(dá)。這表明Thcab1基因能對(duì)鹽和鹽堿脅迫做出應(yīng)答，可能參與了剛毛檉柳的耐鹽、堿過(guò)程，但Thcab1基因在剛毛檉柳耐鹽、堿反應(yīng)中的具體功能差異及調(diào)控機(jī)制等需要進(jìn)一步研究。

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