周 鵬

(南京林業(yè)大學(xué)，南京，210037)

陳慶生 張 敏

(江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院)

張 強(qiáng) 方炎明

(南京林業(yè)大學(xué))

土壤鹽漬化嚴(yán)重影響農(nóng)林生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境，已成為一個世界性的問題[1-2]。耐鹽堿植物的篩選與種植，被認(rèn)為是改良鹽堿地的有效措施[3]。但可供鹽堿地綠化造林的材料少，樹種單一[4]，因此，加強(qiáng)林木耐鹽性研究對于耐鹽樹種的篩選及鹽堿地綜合治理具有重要意義。

研究表明，植物光合作用是對鹽脅迫最敏感的生理過程，而PSⅡ是光合作用受到傷害的最原初部位[5-6]。葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)能夠為研究PSⅡ及其電子傳遞過程提供豐富信息[7]。但傳統(tǒng)的葉綠素?zé)晒鉁y定方法只能測定葉片上某個點的熒光，不能準(zhǔn)確反映整片葉及植株的真實生理狀況[8]。葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)是葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)發(fā)展的最新成果，它不僅能夠測定整葉甚至整株植物的葉綠素?zé)晒猓€能提供各參數(shù)對應(yīng)的葉綠素?zé)晒鈭D像，可供研究者進(jìn)行全面準(zhǔn)確的分析[9]。目前，葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)主要應(yīng)用于葉片光合作用異質(zhì)性的研究[10]和大量樣品(如突變體、除草劑等)的篩選[11-12]及大批量微藻樣品的毒理學(xué)研究[13]。

柳樹屬楊柳科柳屬(Salix L.)喬、灌木，種類多，抗性強(qiáng)[14]。柳樹種質(zhì)資源豐富，是選育耐鹽良種的理想樹種。江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院從20世紀(jì)60年代起開展系統(tǒng)的柳樹栽培和育種工作，已篩選出一批耐鹽柳樹無性系。目前，柳樹耐鹽性的研究大多集中在灌木柳生長指標(biāo)、光合速率[15]、抗氧化酶、蛋白表達(dá)[16]等方面，而柳樹鹽脅迫下葉綠素?zé)晒夥矫娴难芯可胁欢嘁?。本研究?個耐鹽性差異顯著的灌木柳無性系為試材，利用葉綠素?zé)晒獬上駜x，對鹽脅迫下柳樹PSⅡ熒光特性的變化進(jìn)行了研究，探討灌木柳耐鹽特性和耐鹽機(jī)制，為篩選和利用耐鹽樹種提供理論參考。

1 材料與方法

試驗于2013年7月份在南京林業(yè)大學(xué)植物生理實驗室進(jìn)行。供試材料為2個耐鹽性差異明顯的灌木柳雜交種無性系:耐鹽型JW2345(Salix suchowensis×S.integra)和鹽敏感型 JW2367(S.viminalis×S.argyracea)的組織培養(yǎng)苗。

NaCl處理參照張敏等[17]的方法，生根培養(yǎng)30 d后，選取株高一致、根系發(fā)達(dá)、生長健壯的組培生根苗移入塑料套盆中用NaCl溶液處理，每盆50株。NaCl溶液用1/2MS液體培養(yǎng)基配制，用量為每盆500 mL，每2 d更換一次培養(yǎng)液。試驗設(shè)5個濃度梯度，即:0(CK)、50(T1)、100(T2)、150(T3)、200 mmol·L-1(T4)，每個處理重復(fù)3次。培養(yǎng)條件:溫度25℃、空氣相對濕度70%～80%、光照強(qiáng)度500 μmol·m-2·s-1、光周期晝 12 h/夜 12 h。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定:培養(yǎng)7 d后，采用葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)(Chlorophyll fluorescence Imager，CFI)(Technologica，英國)獲取整葉葉綠素?zé)晒鈭D像。每個處理組剪取植株中部有代表性的葉片3片，按區(qū)域平放于自制樣品板，置于樣品室中，整個過程通過FluorImager(Version 2.2)軟件完成(表 1)，直接獲取所有參數(shù)熒光圖像及數(shù)據(jù)。

表1 葉綠素?zé)晒獬上駵y量程序

數(shù)據(jù)處理:所有測定指標(biāo)均重復(fù)3次，結(jié)果取平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。采用CFI自帶軟件FluorImager、Excel 2003及SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并對指標(biāo)差異顯著性利用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫對灌木柳生物量的影響

由表2可知，處理 7 d后，50～100 mmol·L-1NaCl處理下，灌木柳水培苗干質(zhì)量與對照無顯著差異(P＞0.05);隨鹽脅迫的加重，干質(zhì)量均呈不同程度地下降，且JW2367下降幅度大于JW2345。結(jié)果表明，鹽脅迫抑制灌木柳幼苗的生長，且對鹽敏感型JW2367生長的抑制作用大于耐鹽型JW2345。

2.2 鹽脅迫對灌木柳葉Fv/Fm的影響

圖1顯示了不同濃度NaCl處理后灌木柳葉片形態(tài)圖像和PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)熒光成像圖的變化。鹽脅迫下灌木柳葉片均受到傷害，表現(xiàn)為葉片枯萎(圖1A)，且隨著鹽濃度增加傷害程度加大。相同處理下，鹽敏感型JW2367葉片傷害的程度比耐鹽型JW2345明顯(圖1B)。從圖1可看出，熒光圖對鹽脅迫的反應(yīng)較葉片可見傷害更敏感，如T1的 JW2367和 T2的 JW2345，鹽脅迫并未對葉片形態(tài)產(chǎn)生明顯影響，但熒光圖變化明顯。

Fv/Fm反映的是PSII反應(yīng)中心捕獲光能的效率，與有活性的PSⅡ反應(yīng)中心數(shù)量成正比。在非脅迫條件下，F(xiàn)v/Fm一般恒定在 0.74 ～ 0.85[18-19]。由表3可知，對照組中JW2345和JW2367的Fv/Fm分別為0.82和0.81，表明兩者均處于正常生長狀態(tài)。隨著鹽脅迫的加劇，灌木柳Fv/Fm均呈現(xiàn)下降趨勢，且耐鹽型JW2345的Fv/Fm值下降幅度明顯小于鹽敏感型JW2367。其中，T2引起灌木柳Fv/Fm值顯著下降，但對干質(zhì)量未產(chǎn)生顯著影響，說明，F(xiàn)v/Fm值對鹽脅迫的反應(yīng)較干質(zhì)量更為敏感。

2.3 灌木柳葉Fo和Fm對鹽脅迫的響應(yīng)

最小熒光(Fo)是評價植物逆境傷害的重要指標(biāo)之一，與反應(yīng)中心活性有關(guān)[20]。如表3所示，50 mmol·L-1NaCl處理顯著提高了灌木柳Fo值;但經(jīng)100～200 mmol·L-1NaCl脅迫下，兩個無性系的響應(yīng)明顯不同。JW2345的Fo隨著鹽脅迫的加劇而逐步上升，在T4時有所下降，但仍顯著高于對照組，方差分析表明，各處理與對照差異顯著(P＜0.05);JW2367的Fo在T1時顯著高于對照，隨著NaCl濃度增加，F(xiàn)o逐漸恢復(fù)到對照水平，T4時已低于對照組，但差異不顯著。

最大熒光(Fm)可反映PSⅡ電子傳遞的最大潛力，F(xiàn)m下降是光抑制發(fā)生的一個特征[21-22]。由表3表明，隨著鹽濃度的增加，灌木柳Fm均呈下降趨勢，但相同處理下耐鹽型JW2345的Fm值明顯高于鹽敏感型JW2367的。

2.4 鹽脅迫下灌木柳葉F'v/F'm和 ΦP，SⅡ的變化

PSⅡ有效光化學(xué)量子產(chǎn)量(F'v/F'm)是有熱耗散存在的情況下PSⅡ反應(yīng)中心完全開放時的光化學(xué)效率，反映開放的PSⅡ反應(yīng)中心的激發(fā)能捕獲效率[9];PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率(ΦP，SⅡ)反映 PSⅡ反應(yīng)中心部分關(guān)閉的情況下的實際光化學(xué)效率，與碳同化密切相關(guān)[23]。在鹽脅迫下，兩個無性系的 F'v/F'm變化趨勢一致，隨鹽脅迫增加均顯著下降(P＜0.05)(表3)。其中，JW2345的 F'v/F'm值在 T3時下降幅度最大，比對照低38.71%;而JW2367在T4時下降最多，比對照低60.71%。

圖1 鹽脅迫對灌木柳葉Fv/Fm熒光圖的影響

如表3所示，不同濃度NaCl處理下，灌木柳ΦP，SⅡ值較對照均降低，且 JW2345 下降幅度小于JW2367，最大降幅分別為 13.89%和 43.24%(P＜0.05)，表明鹽脅迫可能導(dǎo)致植物同化力(NADPH和ATP)形成被抑制。

2.5 鹽脅迫下灌木柳葉熒光猝滅的分析

熒光猝滅包括光化學(xué)猝滅(qP)和非光學(xué)猝滅(NP，Q)。qP反映PSⅡ天線色素吸收的光能用于光化學(xué)電子傳遞的部分，可以代表PSⅡ反應(yīng)中心開放部分的比例;NP，Q反映的是PSⅡ天線色素吸收的光能不能用于光合電子傳遞而以熱的形式耗散掉的部分[24]。表3顯示了灌木柳qP在鹽脅迫下的變化。灌木柳qP變化一致，受鹽脅迫后均有所增加，且上升幅度隨鹽濃度的增加而增大。

由表3可知，JW2345對照組的 NP，Q明顯低于JW2367的，且差異顯著(P＜0.05)。此外，鹽脅迫下兩個無性系NP，Q的變化趨勢也存在差異。50 mmol·L-1NaCl處理提高了JW2345的NP，Q，比對照提高了24.17%(P＜0.05)，T2、T3、T4 稍低于對照，但差異不顯著;隨著鹽脅迫濃度的增加，JW2367的 NP，Q則呈下降趨勢，在T4時下降幅度最大，比對照下降了66.81%，方差分析表明，除T1外，其他處理與對照均有顯著差異(P＜0.05)。

表3 鹽脅迫對灌木柳葉片熒光參數(shù)的影響

3 結(jié)論與討論

生物量是植物對鹽脅迫反應(yīng)的綜合體現(xiàn)，也是評價植物耐鹽性的重要指標(biāo)[25]。Fv/Fm和Fm是衡量光抑制的重要指標(biāo)，可以反映環(huán)境脅迫程度[19-21]。本試驗結(jié)果顯示，隨鹽脅迫加強(qiáng)，灌木柳干質(zhì)量、Fv/Fm和Fm值均下降，JW2345降幅均低于JW2367，且Fv/Fm與干質(zhì)量存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系(r=0.894，P＜0.01)。表明鹽脅迫導(dǎo)致灌木柳葉片PSⅡ受損，出現(xiàn)光抑制現(xiàn)象[26]，耐鹽型 JW2345受傷害較輕，具有一定的耐鹽能力，這與施士爭等[27]篩選耐鹽灌木柳無性系時所得結(jié)論一致。

本試驗中，鹽脅迫下隨著Fv/Fm的降低，灌木柳ΦP，SⅡ下降，qP則上升，推測鹽脅迫下灌木柳可能通過調(diào)節(jié)PSⅡ反應(yīng)中心開放程度(qP)，以適應(yīng)光抑制的發(fā)生[28]，但由于反應(yīng)中心對激發(fā)能捕獲能力(F'v/F'm)的下降，引起 ΦPSⅡ被迫性下降[10，29]。與本文的研究結(jié)果相似，Askri等[30]發(fā)現(xiàn)葡萄(Vitis vinifera)在鹽處理14 d后qP沒有明顯變化，主要是由于 NP，Q上升引起 F'v/F'm降低，最終導(dǎo)致 ΦP，SⅡ降低。本研究中，鹽脅迫下耐鹽型JW2345通過提高或維持非光化學(xué)能量耗散(NP，Q)來適應(yīng)光合效率的下降，以避免產(chǎn)生光破壞[31];而鹽敏感型 JW2367的NP，Q顯著下降，表明熱耗散機(jī)制嚴(yán)重受損，植物光保護(hù)能力喪失，且此時出現(xiàn)葉尖或葉片枯萎等形態(tài)變化，說明過多激發(fā)能積累已導(dǎo)致葉片嚴(yán)重光破壞。由此可見，鹽脅迫下耐鹽型JW2345葉片NP，Q的變化情況實際反映了植物對逆境所產(chǎn)生的一種自我調(diào)節(jié)和自我保護(hù)機(jī)制[22]，這可能正是其較鹽敏感型JW2367耐鹽的原因之一。

目前，國內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為依賴葉黃素循環(huán)的熱耗散存在于大多數(shù)植物中，并且是一種最主要的方式[32-33]。有研究表明，初始熒光Fo的變化可以推斷反應(yīng)中心狀況和可能的光保護(hù)機(jī)制，依賴葉黃素循環(huán)的熱耗散增加將會導(dǎo)致Fo降低，反應(yīng)中心可逆失活或破壞及類囊體膜受損會引起Fo增加。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫導(dǎo)致耐鹽型JW2345的Fo顯著升高，而此時NP，Q顯著高于或接近對照。由于依賴葉黃素循環(huán)的熱耗散總是導(dǎo)致Fo的降低，顯然，鹽脅迫引起的柳樹葉片F(xiàn)o的增加不能歸因于這個機(jī)制，試驗中Fo的增加很可能是依賴PSⅡ反應(yīng)中心可逆失活的熱耗散運轉(zhuǎn)所致[34]，柳樹葉片通過PSⅡ反應(yīng)中心可逆失活提高自身熱耗散能力，同時伴隨有活性的PSⅡ反應(yīng)中心數(shù)量降低，光抑制產(chǎn)生，這與低鹽處理下NP，Q升高及Fv/Fm降低相吻合。因此，此時光抑制的產(chǎn)生是光合作用的保護(hù)過程[35]。此外，錢永強(qiáng)等[20]研究柳樹經(jīng) Cd2+脅迫時，也發(fā)現(xiàn)在柳樹中可能存在依賴PSⅡ反應(yīng)中心失活的熱耗散機(jī)制。

綜上所述，灌木柳耐鹽性及葉綠素?zé)晒鈱}脅迫的響應(yīng)存在差異，并能通過葉綠素?zé)晒獬上駡D快速、直觀地反映出來，說明葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)可用于耐鹽植物的快速篩選。鹽脅迫下灌木柳起關(guān)鍵保護(hù)作用的很可能是依賴PSⅡ反應(yīng)中心可逆失活的熱耗散機(jī)制，其具體作用機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。

[1]Zhou Jing，Liu Mingying，Jiang Jing，et al.Expression profile of miRNAs in Populus cathayana L.and Salix matsudana Koidz under salt stress[J].Molecular Biology Reports，2012，39(9):8645-8654.

[2]Rao E S，Kadirvel P，Symonds R C，et al.Relationship between survival and yield related traits in Solanum pimpinellifolium under salt stress[J].Euphytica，2013，190(2):215-228.

[3]高彥花，張華新，楊秀艷，等.耐鹽堿植物對濱海鹽堿地的改良效果[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，39(8):43-46.

[4]林士杰，張忠輝，張大偉，等.鹽堿地樹種選擇及抗鹽堿造林技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2012，28(10):1-5.

[5]Codrea M C，Hakala-Yatkin M，K?rlund-Marttila A，et al.Mahalanobis distance screening of Arabidopsis mutants with chlorophyll fluorescence[J].Photosynthesis Research，2010，105(3):273-283.

[6]Koyro H W.Effect of salinity on growth，photosynthesis，water relations and solute composition of the potential cash crop halophyte Plantago coronopus(L.)[J].Environmental and Experimental Botany，2006，56(2):136-146.

[7]Schansker G，Tóth S Z，Holzwarth A R，et al.Chlorophyll a fluorescence:beyond the limits of the Q(A)model[J].Photosynthesis Research，2014，120(1/2):43-58.

[8]王春萍，雷開榮，李正國，等.低溫脅迫對水稻幼苗不同葉齡葉片葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊慬J].植物資源與環(huán)境學(xué)報，2012，21(3):38-43.

[9]Venkateswarlu B，Shanker A K，Shanker C，et al.Crop stress and its management:perspectives and strategies[M].New York:Springer Nethlands，2012:359-398.

[10]杜亮亮，金愛武，胡元斌，等.5種箬竹屬竹種葉綠素?zé)晒馓匦缘谋容^[J].世界竹藤通訊，2009，7(2):17-21.

[11]Oxborough K.Imaging of chlorophyll a fluorescence:theoretical and practical aspects of an emerging technique for the monitoring of photosynthetic performance[J].Journal of Experimental Botany，2004，55(40):1195-1205.

[12]Barbagallo R P，Oxborough K，Pallett K E，et al.Rapid，noninvasive screening for perturbations of metabolism and plant growth using chlorophyll fluorescence imaging[J].Plant Physiology，2003，132(2):485-493.

[13]Chalifour A，Spear P A，Boily M H，et al.Assessment of toxic effects of pesticide extracts on different green algal species by using chlorophyll a fluorescence[J].Toxicological and Environ Chemistry，2009，91(7):1315-1329.

[14]汪有良，王寶松，施士爭.灌木型柳樹鎘吸收積累性狀的研究[J].西北林學(xué)院學(xué)報，2011，26(2):105-110.

[15]隋德宗，王保松，施士爭，等.鹽脅迫對灌木柳無性系幼苗生長及光合作用的影響[J].浙江林學(xué)院學(xué)報，2010，27(1):63-68.

[16]隋德宗，田鑫，施士爭，等.鹽脅迫對灌木柳無性系生長及蛋白表達(dá)的影響[J].林業(yè)科技開發(fā)，2009，23(1):49-51.

[17]張敏，李榮錦，黃利斌，等.NaCl脅迫下構(gòu)樹幼苗液泡膜生理生化響應(yīng)[J].林業(yè)科學(xué)，2009，45(8):50-55.

[18]Lichtenthaler H K，Buschmann C，Knapp M.How to correctly determine the different chlorophyll fluorescence parameters and the chlorophyll fluorescence decrease ratio RFd of leaves with the PAM fluorometer[J].Photosynthetica，2005，43(3):379-393.

[19]楊福孫，孫愛花，王燕丹，等.生長延緩劑對檳榔苗期葉綠素含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2009，25(2):255-257.

[20]錢永強(qiáng)，周曉星，韓蕾，等.3種柳樹葉片PSⅡ葉綠素?zé)晒鈪?shù)對 Cd2+脅迫的光響應(yīng)[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，33(6):8-14.

[21]付連雙，謝甫綈.土壤水分對越冬期間冬小麥葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，42(4):36-41.

[22]柯裕州，周金星，盧楠，等.鹽脅迫對桑樹幼苗光合生理及葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊慬J].林業(yè)科學(xué)研究，2009，22(2):200-206.

[23]謝寅峰，李博，陶功勝，等.納米氧化硅對髯毛箬竹光合熒光特性的影響[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2012，36(2):59-63.

[24]Qiu Nianwei，Lu Qingtao，Lu Congming.Photosynthesis，photosystem II efficiency and the xanthophyll cycle in the salt-adapted halophyte atriplex centralasiatica[J].New Phytologist，2003，159(2):479-486.

[25]Wani A S，Ahmad A，Hayat S，et al.Salt-induced modulation in growth，photosynthesis and antioxidant system in two varieties of Brassica juncea[J].Saudi Journal of Biological Sciences，2013，20(2):183-193.

[26]Demmig-Adams B，Adams Iii W W.Photoprotection and other responses of plants to high light stress[J].Annual Review of Plant Biology，1992，43(1):599-626.

[27]施士爭，隋德宗，王紅玲，等.灌木柳速生無性系的耐鹽性選擇研究[J].西北林學(xué)院學(xué)報，2010，25(4):72-77.

[28]王良桂，張春霞，彭方仁，等.干旱脅迫對幾種楸樹苗木葉片熒光特性的影響[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2008，32(6):119-122.

[29]Baker N R，Rosenqvist E.Applications of chlorophyll fluorescence can improve crop production strategies:an examination offuture possibilities[J].Journal of Experimental Botany，2004，55(43):1607-1621.

[30]Askri H，Daldoul S，Ammar A B，et al.Short-term response of wild grapevines(Vitis vinifera L.ssp.sylvestris)to NaCl salinity exposure:changes of some physiological and molecular characteristics[J].Acta Physiologiae Plantarum，2012，34(3):957-968.

[31]Zhang Hao，Hu Hao，Zhang Xiaobin，et al.Detecting Suaeda salsa L.chlorophyll fluorescence response to salinity stress by using hyperspectral reflectance[J].Acta Physiologiae Plantarum，2012，34(2):581-588.

[32]林榮呈，許長成，李良璧，等.葉黃素循環(huán)及其在光保護(hù)中的分子機(jī)理研究[J].植物學(xué)報，2002，44(4):379-383.

[33]Boughalleb F，Denden M，Tiba B B.Photosystem II photochemistry and physiological parameters of three fodder shrubs，Nitraria retusa，Atriplex halimus and Medicago arborea under salt stress[J].Acta Physiologiae Plantarum，2009，31(3):463-476.

[34]許大全.光合作用效率[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2002:136-153.

[35]Zhao Changming，Wang Genxuan，Wei Xiaoping，et al.Effects of groundwater depth variation on photosynthesis and photoprotection of Elaeagnus angustifolia L.[J].Trees，2007，21(1):55-63.