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        天花粉蛋白基因?qū)霘W美楊1081)

        2014-09-18 11:12:22孫婷婷
        關(guān)鍵詞:天花粉歐美抗性

        孫婷婷 鄒 莉

        (東北林業(yè)大學(xué),哈爾濱,150040)

        許繼飛

        (內(nèi)蒙古大學(xué))

        于 洋

        (東北林業(yè)大學(xué))

        歐美楊 108(Populus euramericana“114/690”)引種于意大利,為美洲黑楊與歐洲黑楊的人工雜種無(wú)性系,該品種在耐旱性、耐寒性、生長(zhǎng)速度、抗病蟲害能力及成材質(zhì)量等方面都非常優(yōu)越,被列為我國(guó)華北和西北重點(diǎn)推廣樹種。但是,隨著歐美楊的廣泛栽培,病蟲害的發(fā)生越來(lái)越嚴(yán)重,因此,其抗性育種顯得尤為迫切。采用基因工程技術(shù)開(kāi)展轉(zhuǎn)基因楊樹的研究,是培育抗逆、抗蟲和抗病楊樹新品種的有效途徑[1]。天花粉蛋白(Trichosanthin,TCS)是從葫蘆科藥用植物栝樓(Trichosanthes kirilowii Maxim)塊根中分離得到的單鏈核糖體失活蛋白(Ribosome Inactivating Protein,RIP),近年來(lái)的研究結(jié)果表明,天花粉蛋白和植物的防御反應(yīng)相關(guān),它對(duì)真菌、病毒和昆蟲有直接或間接的抑制和殺滅作用[2]。利用基因工程手段,將具有抗病和抗蟲特性的天花粉蛋白基因轉(zhuǎn)入歐美楊108,增強(qiáng)其抗逆性,使歐美楊108免遭病蟲危害,具有無(wú)污染,不殺傷天敵,保護(hù)生物多樣性,維持生態(tài)平衡等特點(diǎn),且意義重大。

        目前,闊葉樹種主要采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化[3]。本研究以歐美楊108無(wú)菌苗為材料,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,進(jìn)行抗病蟲天花粉蛋白(Trichosanthin,TCS)基因的遺傳轉(zhuǎn)化研究??剐泽w經(jīng)PCR和PCR-Southern檢測(cè),初步證實(shí)TCS基因已經(jīng)整合到歐美楊108的基因組中。

        1 材料與方法

        植物材料:歐美楊 108(Populus euramericana“114/690”)組培苗由林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))提供。

        菌株和質(zhì)粒:宿主菌 Escherichia coli DH5α,Agrobacterium tumefeciens LBA4404均為北京大學(xué)保藏菌種。pT1-3為北京大學(xué)構(gòu)建含有TCS啟動(dòng)子及結(jié)構(gòu)基因(提取自葫蘆科藥用植物栝樓(Trichosanthes kirilowii Maxim)塊根中)的質(zhì)粒,其中啟動(dòng)子大小約為 1140 bp,結(jié)構(gòu)基因大小約為 760 bp。pCambia1301為北京大學(xué)保藏的質(zhì)粒。pUCm-T質(zhì)粒載體購(gòu)自上海生工公司。

        試劑:各種限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA片段和PCR產(chǎn)物回收試劑盒為Promega公司產(chǎn)品;T4 DNA連接酶和 λDNA/HindⅢ+EcoRⅠMarker為華美生物工程公司產(chǎn)品;Taq DNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司,其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。引物合成和測(cè)序由上海生工公司完成。

        培養(yǎng)基:分化培養(yǎng)基,MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA;預(yù)培養(yǎng)基,MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA;共培養(yǎng)基,MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+200 μmol·L-1AS(乙酰丁香酮);預(yù)篩選培養(yǎng)基,MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+400 mg·L-1Carb(羧卞青霉素);篩選培養(yǎng)基,MS+0.5mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+0.2mg·L-1Hyg(潮霉素)+400 mg·L-1Carb(羧卞青霉素);生根培養(yǎng)基,WPM(木本植物用培養(yǎng)基)+0.4 mg·L-1IBA+0.1 mg·L-1Hyg(潮霉素)+600 mg·L-1Cefo(頭孢噻肟鈉)。

        植物表達(dá)載體構(gòu)建:用限制性內(nèi)切酶SacⅠ和BamHⅠ雙酶切質(zhì)粒pT1-3得到TCS啟動(dòng)子及結(jié)構(gòu)基因,再回收目的片段;同樣使用限制性內(nèi)切酶SacⅠ和BamHⅠ雙酶切質(zhì)粒pCambia1301后得到載體片段并將其回收,將兩者用T4 DNA連接酶16℃過(guò)夜連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)PCR鑒定的陽(yáng)性菌液,提取質(zhì)粒,進(jìn)行SacⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定和雙向測(cè)序。鑒定正確的質(zhì)粒命名為 pC-tPro-TCS[4]。

        農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化歐美楊108:將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體用液氨凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌中。采用葉盤法轉(zhuǎn)化歐美楊108,從平板上挑取經(jīng)PCR驗(yàn)證的陽(yáng)性單菌落放入5 mL含有相應(yīng)抗生素(50 mg·L-1Rif、40 mg·L-1Strep、50 mg·L-1Kan)的 LB 液體培養(yǎng)基中,28℃,190 rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜;取1 mL菌液加入20 mL無(wú)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)6~8 h,在無(wú)菌條件下用無(wú)菌水稀釋菌液至OD600(光密度)為0.4左右;在無(wú)菌條件下,取生長(zhǎng)良好的無(wú)菌苗葉片,將葉片橫斜切成2~3段,葉背向下在黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)2 d;放入農(nóng)桿菌侵染液中侵染15 min,在這一過(guò)程中輕輕振蕩,取出葉片段,用無(wú)菌濾紙吸干;將葉片轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基中于培養(yǎng)室中暗培養(yǎng)2d[5]。葉片枯化后進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄,數(shù)據(jù)用 SPSS和DPS軟件分析。

        轉(zhuǎn)化效率=(形成抗性芽(或抗性愈傷)的葉片數(shù)/總的葉片數(shù))×100%。

        抗性植株的分子生物學(xué)檢測(cè):抗性植株的PCR擴(kuò)增檢測(cè)。采用CTAB法[6]提取植物材料總DNA。以質(zhì)粒DNA作為陽(yáng)性對(duì)照,以未轉(zhuǎn)化的歐美楊108 DNA作為陰性對(duì)照,抗性苗進(jìn)行PCR檢測(cè),根據(jù)TCS結(jié)構(gòu)基因設(shè)計(jì)引物為 5'-GGGAAGCTTTGCCATATTGTTTCGATTC-3'和 5'-GGGCATATGGATGTTAGCTTCCGGTTA-3';PCR反應(yīng)的總體積 25 μL,PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4 min,94℃變性1 min,55℃退火1 min,72℃延伸 1 min,30 個(gè)循環(huán),再72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

        抗性植株的PCR-Southern雜交:采用地高辛標(biāo)定的探針進(jìn)行分子雜交。分子雜交試劑盒為DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ,Cat.No.11745832910。將 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后印跡于硝酸纖維素膜上,以陽(yáng)性質(zhì)粒擴(kuò)增回收產(chǎn)物為模板合成探針,進(jìn)行PCR-Southern雜交檢測(cè)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 植物表達(dá)載體pC-tPro-TCS鑒定

        質(zhì)粒pCambia 1301為11.8 kb,在多克隆位點(diǎn)上有SacⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn),SacⅠ和BamHⅠ之間有10 bp。質(zhì)粒pT1-3的SacⅠ與BamHⅠ位點(diǎn)之間約為96 bp,TCS啟動(dòng)子及結(jié)構(gòu)基因長(zhǎng)為1.9 kb,所以構(gòu)建的重組質(zhì)粒 pC-tPro-TCS大小約為13.7 kb。提取重組質(zhì)粒pC-tPro-TCS,進(jìn)行KpnⅠ和BglⅡ雙酶切鑒定,得到約2.0 kb和11.7 kb兩個(gè)片段,所得酶切產(chǎn)物片段大小與預(yù)期相符。此外,雙向測(cè)序結(jié)果也表明,克隆的TCS啟動(dòng)子及結(jié)構(gòu)基因序列是正確的。

        2.2 植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

        將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體經(jīng)凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404,在附加卡那霉素、利福平和鏈霉素的LB培養(yǎng)基上篩選。挑取陽(yáng)性克隆,一部分搖菌、提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增,另一部分進(jìn)行菌落直接PCR鑒定,兩者均特異的擴(kuò)增出約760 bp大小的TCS結(jié)構(gòu)基因;除此之外,提取質(zhì)粒進(jìn)行KpnⅠ和BglⅡ雙酶切鑒定,所得酶切產(chǎn)物大小與預(yù)期相符,結(jié)果表明,已成功地將含有天花粉蛋白(TCS)基因的pC-tPro-TCS植物表達(dá)載體導(dǎo)入了根癌農(nóng)桿菌LBA4404。

        2.3 歐美楊108轉(zhuǎn)化抗性再生植株的獲得

        歐美楊108葉片經(jīng)農(nóng)桿菌侵染和共培養(yǎng)后,在含有2 mg·L-1Hyg(潮霉素)的篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選,2個(gè)月后,移入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根,獲得再生植株(圖1、圖2)。本研究轉(zhuǎn)化420個(gè)外植體,共獲得18個(gè)抗性愈傷和抗性芽,轉(zhuǎn)化效率為4.3%。

        2.4 抗性植株的PCR擴(kuò)增檢測(cè)

        取抗性植株基因組DNA做模板,以農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA作為陽(yáng)性對(duì)照,以未轉(zhuǎn)化植株為陰性對(duì)照,用TCS結(jié)構(gòu)基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果如圖3所示,未轉(zhuǎn)化植株的基因組未出現(xiàn)PCR特異擴(kuò)增片斷,抗性植株與質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增條帶相同,大小均為760 bp。因此,初步證明了目的基因TCS已經(jīng)整合到受體歐美楊108的基因組中。

        圖1 選擇培養(yǎng)基上抗性芽的獲得

        圖2 轉(zhuǎn)基因苗

        圖3 Hyg抗性再生植株的PCR檢測(cè)電泳分析

        2.5 抗性植株的PCR-Southern雜交

        為了進(jìn)一步證明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是目的基因片段,將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后印跡于硝酸纖維素膜上,以陽(yáng)性質(zhì)粒擴(kuò)增回收產(chǎn)物為模板合成探針,進(jìn)行PCR-Southern雜交檢測(cè),結(jié)果表明,轉(zhuǎn)入TCS基因植株和對(duì)照一樣,均顯示出較強(qiáng)的雜交信號(hào)。結(jié)果見(jiàn)圖4。在檢測(cè)過(guò)的4個(gè)抗性植株中,全部呈陽(yáng)性。進(jìn)一步證明了TCS基因已整合到了歐美楊108基因組中。

        圖4 Hyg抗性再生植株的PCR-Southern檢測(cè)

        3 結(jié)束語(yǔ)

        近年來(lái),天花粉蛋白(Trichosanthin,TCS)基因被轉(zhuǎn)入不同植物中,徐瓊芳等[7]將天花粉蛋白基因?qū)胄←溨校l(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)天花粉蛋白基因的小麥對(duì)黃矮病的抗性得到顯著提高。Yan et al.[8]、Ming et al.[9]將天花粉蛋白基因與35S啟動(dòng)子融合,通過(guò)改進(jìn)的基因槍技術(shù),轉(zhuǎn)入到Zhonghua 8中,獲得了天花粉蛋白穩(wěn)定表達(dá)的陽(yáng)性植株,同時(shí),還發(fā)現(xiàn)天花粉蛋白作為外源基因的引入并沒(méi)有對(duì)水稻的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響。周長(zhǎng)梅[10]采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法首次將天花粉蛋白基因?qū)肽颈局参锲咸阎校@得了PCR陽(yáng)性植株。2011年劉靜等[11]將 TCS基因轉(zhuǎn)化泡桐,通過(guò)抗性試驗(yàn)表明,轉(zhuǎn)TCS基因泡桐對(duì)叢枝病具有一定的抗性。到目前為止,還未見(jiàn)有利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將TCS基因轉(zhuǎn)入歐美楊108的研究報(bào)道。

        本研究構(gòu)建了含有TCS啟動(dòng)子和結(jié)構(gòu)基因的植物表達(dá)載體,對(duì)構(gòu)建的植物表達(dá)載體pC-tPro-TCS的鑒定時(shí),采用的是KpnⅠ和BglⅡ雙酶切,而不是SacⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定,KpnⅠ和BglⅡ分別位于SacⅠ的上游和BamHⅠ的下游,這樣酶切和測(cè)序的結(jié)果更為準(zhǔn)確。將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功導(dǎo)入歐美楊108植株中,抗性體經(jīng)PCR和PCR-Southern檢測(cè)可以初步證實(shí)外源基因整合到基因組中[12-14],而對(duì)于TCS基因是否真正整合到歐美楊108的基因組中則需要進(jìn)一步試驗(yàn),例如是否有報(bào)告基因蛋白表達(dá)的染色等[15]。

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        [4]鄒莉.天花粉蛋白基因表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化楊樹的研究[D].哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué),2005.

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