張彬彬，楊春華，竇博鑫，劉琳琳，鄒麗宏，石彥國，劉 穎

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，哈爾濱 150076）

米曲霉40214高產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵條件的優(yōu)化*

張彬彬，楊春華，竇博鑫，劉琳琳，鄒麗宏，石彥國，劉 穎**

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，哈爾濱 150076）

運(yùn)用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)，對米曲霉40214菌株發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶的培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在提高菌株產(chǎn)中性蛋白酶的產(chǎn)量。通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定了發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組分，添加葡萄糖8.0%，酵母粉4.0%，Na2HPO40.10%；最適發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度28℃，初始pH值6.5，發(fā)酵時間96 h，加水量60.0%，經(jīng)過優(yōu)化后酶活性提高了1.75倍，達(dá)到2 845.68 U/mL，實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步提高米曲霉40214菌株產(chǎn)中性蛋白酶的能力并將其應(yīng)用到食品發(fā)酵中奠定了理論基礎(chǔ)。

米曲霉；中性蛋白酶活力；發(fā)酵條件

中性蛋白酶是一種最早發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于生產(chǎn)的工業(yè)酶制劑，現(xiàn)在已經(jīng)廣泛應(yīng)用在毛皮、皮革、絲綢、食品、醫(yī)藥、釀造等方面[1-9]，在食品和醫(yī)藥工業(yè)中尤為突出。但中性蛋白酶成本高、產(chǎn)量低等因素限制了其大規(guī)模生產(chǎn)[10-11]。因此，對該酶類生產(chǎn)技術(shù)的研究得到了廣泛關(guān)注。

微生物蛋白酶，主要由細(xì)菌、霉菌[12-14]，其次由放線菌、酵母菌生產(chǎn)。米曲霉的酶系復(fù)雜，胞內(nèi)酶有氧化還原酶等[15]；分泌的胞外酶有蛋白酶、糖化酶、淀粉酶、果膠酶、谷氨酰胺酶、纖維素酶、半纖維素酶等。米曲霉是醬油釀造中的常用生產(chǎn)菌株，具有很強(qiáng)的糖化淀粉和分解蛋白質(zhì)的能力，醬油釀造的過程，就是利用種曲培養(yǎng)米曲霉，使其能夠大量繁殖，分泌多種酶，其中最為主要的是蛋白酶和淀粉酶[16-17]。其中，蛋白酶活性的高低對于保證產(chǎn)品品質(zhì)、提高原料利用率和控制生產(chǎn)成本具有重要作用[18]。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

菌種：米曲霉40214（CICC）；干酪素、營養(yǎng)瓊脂、蛋白胨、牛肉粉、酵母浸粉：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；氯化鈉、氯化鈣、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無水碳酸鈉、三氯乙酸、福林酚試劑[19]（分析純）：西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

單人潔凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾濱儀器制造有限公司；722型分光光度計(jì)：上海儀分科學(xué)儀器有限公司；雷磁PHS-3C pH計(jì)：南京互川電子有限公司；XFS-280手提式壓力蒸汽滅菌鍋：浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；DKZ電熱恒溫震蕩水槽、電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海-恒科學(xué)儀器有限公司；80-2離心機(jī)：上海浦東光學(xué)儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 米曲霉初始發(fā)酵條件 種子培養(yǎng)基：蔗糖30.0 g，NaNO33.0 g，MgSO4· 7H2O 0.5 g，KCl 5.0 g，F(xiàn)eSO4· 4H2O 0.01 g，KH2PO41.0 g，瓊脂15.0 g，加入蒸餾水 1 000 mL，在pH 6.0～6.5，121℃、0.1MPa條件下，滅菌20min；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮10.0 g，加蒸餾水8 mL，在121℃、0.1MPa下，滅菌20min。

吸取10mL無菌水加入菌種斜面三角瓶中，用接種環(huán)將三角瓶內(nèi)斜面上的孢子輕輕刮下，倒入帶有4層擦鏡紙（滅菌）的無菌漏斗過濾，將過濾后的菌液注入到無菌并盛有小玻璃珠的50mL三角瓶中，同樣方法重復(fù)3次，將剩余的孢子全部沖洗干凈，28℃、200 r/min，振蕩30min，使孢子充分分散，要求孢子分散率超過90.0%，得到單孢子懸液。將菌懸液以2.0%（V/V）的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基（100/250mL），28℃、pH 7.0、培養(yǎng)72 h，以中性蛋白酶活力作為評價指標(biāo)。

1.3.2 米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化 單因素實(shí)驗(yàn)：分別考察碳源種類及其添加量、氮源種類及其添加量和無機(jī)鹽對產(chǎn)中性蛋白酶的影響；正交實(shí)驗(yàn)：在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定碳源、氮源、無機(jī)鹽這3個因素對米曲霉菌株產(chǎn)蛋白酶活力具有顯著性影響（P＜0.05），選取L9（34）正交表分別進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，以中性蛋白酶活力為評價指標(biāo)，進(jìn)行米曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基組分的優(yōu)化。

1.3.3 米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化 利用優(yōu)化的培養(yǎng)基，采用單因素對培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，分別考察時間、溫度、初始pH、加水量對產(chǎn)中性蛋白酶的影響。

1.3.4 中性蛋白酶活力測定 按照國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T23527—2009），采用Folin-酚法測定中性蛋白酶活力[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源種類對米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶的影響

由圖1可知，實(shí)驗(yàn)選取的幾種碳源，均能夠被米曲霉利用產(chǎn)生蛋白酶。對于菌株40214在葡萄糖（P＜0.05）作為碳源時所產(chǎn)酶活最大，為1 920.59U/mL，淀粉次之，菌種對這2種碳源利用效果較好，這可能與菌體蛋白酶系的合成有關(guān)。而以蔗糖作為碳源時，菌株酶活最低為1 800.55U/mL。結(jié)果可能說明單糖比二糖更能促進(jìn)菌體產(chǎn)酶，因而選擇葡萄糖作為碳源。

圖1 碳源對米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶的影響

2.2 氮源種類對菌株產(chǎn)中性蛋白酶的影響

在微生物的代謝過程中，氮源主要被轉(zhuǎn)化為核酸、氨基酸以及構(gòu)成細(xì)胞壁的成分，并且是微生物生長的主要營養(yǎng)。由圖2可知，選取的幾種氮源，在相同培養(yǎng)時間，產(chǎn)酶能力有所不同，酵母粉（P＜0.05）作為氮源時，菌株40214產(chǎn)酶活力最佳，為2 057.25 U/mL。當(dāng)選用大豆粉作氮源時，菌株產(chǎn)酶能力只是略低于酵母粉，為2 023.95 U/mL，考慮到實(shí)際的生產(chǎn)情況，選擇大豆粉作為氮源更能節(jié)約成本，并且達(dá)到良好的產(chǎn)酶效果。

2.3 葡萄糖添加量對米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶的影響

碳源是霉菌發(fā)酵中所需最大的營養(yǎng)物質(zhì)，碳源添加量直接影響菌種的產(chǎn)酶情況。由圖3可以看出，當(dāng)葡萄糖添加量為2.0%～8.0%時，菌株40214的蛋白酶活顯著上升（P＜0.05），達(dá)到8.0%時對碳源的利用效果最好，產(chǎn)生的酶活最高，達(dá)到2 097.30U/mL，隨著碳源濃度的繼續(xù)增加，可看出酶活力有較顯著下降，可知高濃度的葡萄糖比低濃度葡萄糖對產(chǎn)酶有較高的影響。

圖2 氮源種類對米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶的影響

圖3 葡萄糖添加量對米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶的影響

2.4 酵母粉添加量對米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶的影響

酶本身是蛋白質(zhì)，而氮元素是構(gòu)成蛋白質(zhì)的主要元素，因此氮源添加量對于產(chǎn)酶有重要作用。實(shí)驗(yàn)測定了不同添加量的酵母粉對菌株產(chǎn)酶的影響，由圖4可以看出，當(dāng)酵母粉添加量為2.0%～4.0%時，菌株40214的蛋白酶活顯著上升（P＜0.05），當(dāng)酵母粉添加量為4.0%時，菌株對氮源的利用效果達(dá)到最好，達(dá)到2 199.00 U/mL。而當(dāng)酵母粉添加量高于4.0%時，由于濃度增加，會導(dǎo)致溶液變得粘稠，使底物流動性下降，不利于菌種生長及產(chǎn)酶。

圖4 酵母粉添加量對米曲霉中性蛋白酶的影響

2.5 無機(jī)鹽對米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶活力的影響

由圖5可以看出，Na2HPO4和KNO3（P＜0.05）對菌株40214產(chǎn)酶均有促進(jìn)作用，Na2HPO4的促進(jìn)作用更明顯，能夠使酶活達(dá)到2 234.01 U/mL，由于Na+能使細(xì)胞膜內(nèi)外滲透壓改變，膜通透能力增加，而微生物原蛋白水解酶均為胞外酶，膜內(nèi)外滲透壓的改變有利于酶從膜內(nèi)往外運(yùn)輸，并且Na+可能對目的菌株具有一定的激活作用，因而產(chǎn)酶效果較好。而添加的FeSO4和MgSO4對產(chǎn)酶均有不同程度的抑制作用，而FeSO4的抑制效果最明顯，可能是由于FeSO4破壞了酶的次級鍵，改變了酶的三維結(jié)構(gòu)，即變性作用，這種原因引起的酶活性降低或喪失叫做鈍化作用[21]。

圖5 無機(jī)鹽對米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶的影響

2.6 米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶最佳發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，米曲霉40214選取對中性蛋白酶活力影響顯著（P＜0.05）的葡萄糖、酵母粉、Na2HPO4為考察對象，選用L9(34)分別進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，采用SPSS17.0進(jìn)行分析，結(jié)果見表1、2。

米曲霉40214正交實(shí)驗(yàn)極差分析結(jié)果由表1可知，對蛋白酶活力影響大小為：Na2HPO4>葡萄糖>酵母粉，優(yōu)化的最優(yōu)產(chǎn)酶條件為A2B2C1，即葡萄糖8.0%、酵母粉4.0%、Na2HPO40.05%，與正交表中方案5符合，為2 227.35U/mL；由于Na2HPO4影響顯著，當(dāng)選擇實(shí)驗(yàn)條件為A2B2C2，即葡萄糖8.0%、酵母粉4.0%、Na2HPO40.10%，在此條件下測得蛋白酶活力為2 233.57U/mL，因此選取A2B2C2為最優(yōu)結(jié)果。

2.7 培養(yǎng)溫度對米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶的影響

由圖6可知，發(fā)酵溫度在24～28℃時，菌株產(chǎn)酶活力呈逐步升高的趨勢（P＜0.05），而當(dāng)培養(yǎng)溫度在28～40℃范圍產(chǎn)酶活力下降，由于超過某一值時，會導(dǎo)致部分酶變性失活，化學(xué)反應(yīng)速率和代謝減弱，代謝產(chǎn)物減少，最初大量繁殖的細(xì)菌會分解代謝產(chǎn)生熱量，使底物濃度更高，促進(jìn)細(xì)菌衰老[22]。菌株均在28℃時達(dá)到最適溫度，此時40214菌株達(dá)到2 220.68U/mL。溫度不僅影響各種酶的反應(yīng)速率和蛋白質(zhì)性質(zhì)，還會影響發(fā)酵液的物理性質(zhì)。溫度升高使反應(yīng)速率和生長代謝加快，提高微生物代謝物產(chǎn)量，但會導(dǎo)致菌體的衰老，并縮短了發(fā)酵周期，使產(chǎn)酶量減少。

2.8 培養(yǎng)時間對米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶的影響

發(fā)酵時間影響菌體生長情況和蛋白酶產(chǎn)量。由圖7可知，在發(fā)酵48 h內(nèi)，發(fā)酵液中產(chǎn)酶量很低，培養(yǎng)時間在48～96 h時，菌株蛋白酶活力在逐漸上升（P＜0.05），而當(dāng)培養(yǎng)時間在96 h時，蛋白酶的活力達(dá)到最大值。在之后延長培養(yǎng)時間，蛋白酶活力有明顯的（P＜0.05）下降趨勢，因在發(fā)酵后階段，底物不斷消耗的同時，微生物也在逐漸衰亡，導(dǎo)致產(chǎn)酶下降，也可能是因?yàn)榫w死亡導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)自溶現(xiàn)象導(dǎo)致的。所以培養(yǎng)時間均確 定為96 h，此時40214菌株達(dá)到2 695.82U/mL。

表1 米曲霉40214培養(yǎng)基優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 米曲霉40214培養(yǎng)基優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.9 初始pH對米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶的影響

由于發(fā)酵過程中的pH很難準(zhǔn)確控制，所以選擇控制發(fā)酵液的初始pH。由圖8可知，菌株的初始pH在pH 5.5～6.5范圍內(nèi)產(chǎn)酶效果較好（P＜0.05），pH為6.5時，菌種40214酶活最高，為2 735.83U/mL。說明中性培養(yǎng)基有利于菌株產(chǎn)酶；堿性培養(yǎng)基不利于菌株產(chǎn)酶。pH通過影響菌體營養(yǎng)物質(zhì)離子化程度、細(xì)胞膜電荷及膜滲透性，從而影響菌體對養(yǎng)分的吸收。對于大多數(shù)菌種來說，一般具有保持其體內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)酸度在近中性條件下的能力，利于新陳代謝和各種酶反應(yīng)，但底物的pH對細(xì)胞的新陳代謝和產(chǎn)酶有間接的影響，在不同的初始pH下菌種的生長繁殖能力和產(chǎn)中性蛋白酶的能力存在一定的差異。

2.10 加水量對米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶的影響

由圖9可以看出，加水量在50.0%～60.0%時，隨著培養(yǎng)基加水量的增加，菌株40214的蛋白酶活力顯著增加（P＜0.05），當(dāng)加水量為60.0%時蛋白酶活力達(dá)到最大值，為2 845.68 U/mL，比50%時的2 312.34U/mL提高了1.23%，此后再提高加水量則不利于蛋白酶的產(chǎn)生。這是因?yàn)榛|(zhì)加水量過高，基質(zhì)容易粘結(jié)成團(tuán)，多孔性降低，不利于菌體獲得營養(yǎng)，也影響氧氣的傳遞；反之加水量過低，則使基質(zhì)膨脹程度降低，水的活度低，抑制菌體生長。適宜的加水量有利于米曲霉生長繁殖及孢子的形成，從而影響中性蛋白酶的活性。

圖6 培養(yǎng)溫度對米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶的影響

圖7 培養(yǎng)時間對米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶的影響

圖8 pH對米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶的影響

圖9 加水量對米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶的影響

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)對米曲霉40214產(chǎn)中性蛋白酶的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。對碳源種類、氮源種類、碳源添加量、氮源添加量和無機(jī)鹽種類進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，利用單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，最終確定米曲霉40214產(chǎn)中性蛋白酶的最佳條件為：葡萄糖8.0%，酵母粉4.0%，Na2HPO40.10%，初始pH 6.5，發(fā)酵周期96 h，發(fā)酵溫度28℃，加水量為60.0%，酶活達(dá)到2 845.68U/mL，提高了1.75倍。

米曲霉產(chǎn)蛋白酶的活力除了對培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，還能夠通過其他方式進(jìn)行提高。首先，實(shí)驗(yàn)中選擇無機(jī)鹽Na2HPO4，對米曲霉40214產(chǎn)中性蛋白酶具有促進(jìn)作用，但對其添加量并沒有進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，所以最終選擇的0.10%是相對最佳值，還可進(jìn)一步提高；其次，一些表面活性劑也可能會促進(jìn)產(chǎn)酶；第三，米曲霉菌株對紫外線敏感，可利用紫外誘變進(jìn)行菌種選育，能夠進(jìn)一步提高其酶的產(chǎn)量[23-24]。米曲霉能夠分泌多種酶，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等[25]，產(chǎn)生酶系與數(shù)量密切相關(guān)，因此實(shí)驗(yàn)菌株要應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，應(yīng)對其產(chǎn)生的多種酶進(jìn)行系統(tǒng)的檢測，明確相互之間的影響，并對生產(chǎn)成本與產(chǎn)品品質(zhì)進(jìn)行辨證考慮，才能最終確定最佳的工業(yè)發(fā)酵條件。

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Optimum Fermentation Conditions for Producing Neutral Protease fromAspergillus oryzae40214

Zhang Binbin,Yang Chunhua,Dou Boxin,Liu Linlin,Zou Lihong,ShiYanguo,Liu Ying
（Collegeof Food Engineering,Harbin University ofCommerce,Harbin 150076,China）

Using modern biological technology,medium compositions and fermentation conditions for producingmore neutral protease through the cultivation of Aspergillus oryzaewere optimized.With single factor trial and orthogonal experiment,the optimalmedium compositions determined were:8.0%glucose,4.0%yeast extract and 0.10%Na2HPO4.The optimal fermentation conditions obtained were:culture temperatureof28℃,the initialpH of6.5 and cultivation timeof96 h,60.0%addition ofwater.Theactivity of neutral protease was enhanced to 2 845.68 U/mL.The results provide a theoretical foundation for improvingneutralproteaseproduction and application in food fermentation ofAspergillusoryzae40214.

Aspergillusoryzae;Neutralprotease activity;Fermentation condition

TS201.3

B

1674-3547(2014)01-0031-07

2013-12-19

張彬彬，女，碩士，研究方向?yàn)榇蠖够瘜W(xué)與技術(shù)，E-mail:bbhgds@163.com

十二五國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD34B03）

劉穎，女，教授，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)，E-mail:154057693@qq.com