劉 超，潘曉艷，朱慧娟，袁夢丹，蔡紅陽，孫 莉

（大連大學 醫(yī)學院，遼寧 大連 116622）

0 引言

海馬是應激領域研究的一個重點，有研究表明慢性應激可以損傷海馬神經元[1-3]。其損傷機制可能是在應激狀態(tài)下，下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸持續(xù)激活，引起血漿糖皮質激素（GC）釋放增多，作用于海馬區(qū)GC受體，導致海馬CA3區(qū)神經元發(fā)生萎縮、甚至死亡[4]。前期研究顯示中藥加味保元湯具有抗應激作用[5-7]，本實驗采用慢性束縛應激大鼠模型，進一步觀察加味保元湯對慢性束縛應激大鼠海馬 CA3區(qū)神經元損傷的保護作用，以探索加味保元湯抗應激作用的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物分組及處理

健康雄性SD大鼠30只，體重180～220g，清潔級，由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供。隨機等分為5組：正常對照組、模型組、加味保元湯高劑量組、加味保元湯中劑量組和加味保元湯低劑量組。

1.1.2 實驗儀器與試劑

顯微攝像機：OLYMPUS-BX63；石蠟切片機：LEICA RM2255。

加味保元湯由人參、黃芪、肉桂、甘草、五味子分別以5：6：5：3：5比例構成，水提取物由本校中藥研究室制備。

1.2 方法

1.2.1 應激模型制作

正常對照組，不給予任何刺激，其它各組大鼠每日束縛 1次，每日開始時間及束縛時間不同，第 1天為4 h，其后每次增加30～60 min，連續(xù)3周。束縛期間禁食水。加味保元湯高、中、低劑量組束縛前分別給予300 mg/kg體重、200 mg/kg體重和100 mg/kg體重加味保元湯水提取物灌胃；模型組，給予束縛制動刺激不給予中藥，但束縛前給予等量生理鹽水灌胃；正常對照組，不給予任何刺激，但以等量生理鹽水灌胃。

1.2.2 蘇木素-伊紅染色

光鏡下觀察各組大鼠海馬CA3區(qū)神經元形態(tài)、結構：實驗結束后，各組大鼠分別用 10%水合氯醛0.4 g/kg體重腹腔注射麻醉，先后用冷生理鹽水和4%多聚甲醛主動脈灌流固定，繼之剝取腦塊在4%多聚甲醛固定過夜，然后乙醇脫水，二甲苯滲透透明，石蠟包埋切片，片厚5 μm。蘇木素-伊紅染色，中性樹膠封固。然后光鏡下觀察各組大鼠海馬神經元形態(tài)、結構變化，并拍攝圖片。

2 結果

海馬CA3區(qū)神經元，正常對照組：錐體細胞排列整齊、密集，細胞有光暈，胞體呈橢圓形，胞膜完整，胞質均勻透亮，核膜清楚，胞核清晰；模型組細胞排列稀疏,錐體細胞數明顯減少，胞體膨脹，胞膜不完整，胞質不均勻，核膜不清，胞核固縮；加味保元湯中劑量組錐體細胞排列較整齊、較密集，細胞有光暈，胞膜較完整，胞體呈橢圓形，胞質較均勻，胞膜較完整，核膜較清，胞核較清晰，與正常組比較接近；加味保元湯高、低劑量組錐體細胞排列稀疏,錐體細胞數減少，胞體膨脹，胞膜不完整，胞質不均勻，核膜不清，胞核固縮。以上結果說明束縛應激對大鼠海馬CA3區(qū)神經元有明顯損傷，中劑量加味保元湯對其損傷有明顯保護作用。CA1區(qū)無明顯變化，結果見圖1-圖5：

圖1 正常對照組大鼠海馬CA3區(qū)神經元×200

圖2 模型組大鼠海馬CA3區(qū)神經元×200

圖3 加味保元湯高劑量組大鼠海馬CA3區(qū)神經元×200

圖4 加味保元湯中劑量組大鼠海馬CA3區(qū)神經元×200

圖5 加味保元湯低劑量組大鼠海馬CA3區(qū)神經元×200

3 討論

應激是指機體對內外環(huán)境刺激因素所做出的適應性反應。過度應激可引起機體下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸持續(xù)激活，下丘腦促腎上腺皮質激素釋放激素(CRF)釋放增多，進而促使垂體促腎上腺皮質激素(ACTH)釋放，ACTH作用于腎上腺皮質，引起 GC釋放增多，從而引起神經內分泌紊亂，并造成中樞神經系統(tǒng)損傷和功能紊亂。

在中樞神經系統(tǒng)中，海馬是與認知行為功能密切相關的重要腦區(qū)，由于富含 GC受體，而且是中樞GC受體含量最高的腦區(qū)，所以應激時，海馬區(qū)極易選擇性地受到高濃度GC的攻擊，導致海馬器質性損害[4]。

已有研究表明慢性應激可以損傷海馬神經元[1-3]。且研究顯示慢性束縛應激主要使大鼠海馬CA3區(qū)在形態(tài)、結構上出現一系列損害：錐體細胞數減少，頂樹突縮短，電鏡下細胞核固縮，核膜皺縮，線粒體脊模糊，空泡樣變性，粗面內質網模糊不清等，而不發(fā)生在 CA1區(qū)[8]。本實驗結果也清楚地顯示模型組大鼠海馬CA3區(qū)錐體細胞排列稀疏，錐體細胞數減少，胞體膨脹，胞膜不完整，胞質不均勻，核膜不清，胞核固縮；CA1區(qū)無明顯變化，與文獻資料相符合。

慢性應激致海馬損傷的機制尚不十分清楚，目前許多研究者認為高糖皮質激素（GC）血癥可能是其中的主要原因[2,9-10]。Magarios等研究發(fā)現長期暴露于高水平皮質酮條件下會導致大鼠海馬CA3區(qū)錐體細胞減少，原因之一是皮質酮可能通過對大鼠海馬神經元受體的作用影響神經元的功能[11]。本次實驗結果顯示束縛應激致海馬CA3區(qū)神經元的損傷，也可能與血清皮質酮濃度升高有關。其機制還需進一步研究。

應激機制研究較多，但抗應激藥物的研究不多，目前中藥抗應激作用研究正在引起重視。有研究表明中藥對慢性應激大鼠海馬神經元具有保護作用[12,13]，但尚未見加味保元湯對慢性應激大鼠海馬神經元損傷影響的研究報道。

保元湯由人參、黃芪、甘草、肉桂等四味藥組成，具有補氣溫陽之功效。《張氏醫(yī)通》將此方列為補氣類諸方之首，認為補中益氣湯、升陽益胃湯、十全大補湯、人參養(yǎng)營湯均由該方變化而成，可見，保元湯實屬一補氣之祖方。因五味子具有寧心安神之功效[14]，所以，我們在保元湯中加入五味子，作為本研究的加味保元湯使用。前期研究表明，加味保元湯具有一定的抗應激作用[4-6]。本次實驗結果顯示，加味保元湯中劑量組大鼠海馬CA3區(qū)神經元形態(tài)、結構接近正常對照組，與模型組比較損傷較小，說明加味保元湯對慢性束縛應激大鼠海馬CA3區(qū)神經元損傷有一定的保護作用，關于加味保元湯抗應激作用機制還需進一步研究。

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