白晶，苑慶爽，李煒玲

（大連醫(yī)科大學(xué) 生物技術(shù)系，遼寧 大連 116044）

松樹(shù)皮原花青素抑菌作用穩(wěn)定性的研究

白晶，苑慶爽，李煒玲Δ

（大連醫(yī)科大學(xué) 生物技術(shù)系，遼寧 大連 116044）

目的評(píng)估松樹(shù)皮原花青素抑菌作用的穩(wěn)定性。方法采用K-B紙片擴(kuò)散法：以松樹(shù)皮原花青素為材料，以常見(jiàn)腐敗細(xì)菌為供試菌種，觀察松樹(shù)皮原花青素的抑菌活性以及溫度、pH值、紫外線(xiàn)對(duì)其抑菌活性的影響。結(jié)果松樹(shù)皮原花青素對(duì)革蘭陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌)有明顯的抑制作用，松樹(shù)皮原花青素對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）分別為12．5 mg/mL和6．25 mg/mL，在pH值偏中性時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有較好的抑制效果，溫度及紫外線(xiàn)對(duì)其抑菌作用影響較小，而對(duì)革蘭陰性菌(大腸埃希氏菌及銅綠色假單胞菌)則無(wú)明顯抑制作用。結(jié)論松樹(shù)皮原花青素對(duì)革蘭陽(yáng)性菌有明顯的抑制作用，在pH 6～pH 7范圍內(nèi)對(duì)綜合殺菌效果較強(qiáng)，溫度和紫外線(xiàn)對(duì)其抑菌作用幾乎沒(méi)有影響，其抑菌作用受外界影響小，穩(wěn)定性好。

松樹(shù)皮原花青素；紙片擴(kuò)散法；抑菌作用；穩(wěn)定性；革蘭陰性菌；革蘭陽(yáng)性菌

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料與儀器 大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、銅綠色假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus Sukatilis）（美國(guó)ATCC菌種庫(kù)）。固體培養(yǎng)基所用的材料購(gòu)自北京希凱創(chuàng)新科技有限公司、天津市申泰化學(xué)試劑有限公司和北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。松樹(shù)皮提取物原花青素購(gòu)自陜西森弗高科實(shí)業(yè)有限公司。青霉素G（C 001）和慶大霉素為杭州天河微生物試劑有限公司產(chǎn)品。主要設(shè)備包括：自動(dòng)式電熱壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠，LDZX-40 B）、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司，DHG-9071 A）、垂直潔凈工作臺(tái)（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，SW-CJ-2 FD）、電熱恒溫隔水式培養(yǎng)箱 （黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司，SGSP-02）、恒溫培養(yǎng)搖床（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，QYC-200）、數(shù)顯三用恒溫水槽（上海浦東物理光學(xué)儀器廠，HH-W 420）、數(shù)字酸度計(jì)（鄭州寶晶電子科技有限公司，PHS-3 C）。

1.2 菌種活化及菌懸液的制備[14]將所有供測(cè)試的細(xì)菌分別接種于LB固體斜面培養(yǎng)基上，細(xì)菌置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，連續(xù)傳代2次。將上述活化好的各菌種用生理鹽水將其稀釋成含菌量為106～107 CFU/mL的菌懸液備用。

1.3 LB平板培養(yǎng)基的制備[15]將配制好的LB 培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌（121℃、20 min），冷卻至50℃～60℃，無(wú)菌操作傾注于滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每培養(yǎng)皿裝15～20 mL，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 原花青素溶液的制備 稱(chēng)取0.75 g OPC溶于3 mL無(wú)菌水中，漩渦混勻，并用無(wú)菌水稀釋成所需濃度（250、200、150、100、50、25 mg/mL）備用。

1.5 抑菌試驗(yàn)方法[16]將吸水性強(qiáng)的濾紙片用打孔器制成直徑為6 mm的圓形濾紙片。將濾紙高壓滅菌后浸入無(wú)菌水、濃度為 250、200、150、100、50、25 mg/mL 的原花青素溶液中30 min，待其干燥后使用。并以慶大霉素和青霉素作為陽(yáng)性對(duì)照。分別在LB培養(yǎng)基表面加入0.02 mL供試菌的菌懸液，用無(wú)菌涂布器涂布均勻，15 min后用無(wú)菌鑷子夾取濾紙片貼于涂菌平板上，于37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況，采用十字交叉法測(cè)定抑菌圈兩個(gè)垂直方向的直徑大小，取其平均值（mm）為測(cè)定結(jié)果，每項(xiàng)抑菌實(shí)驗(yàn)均平行重復(fù)3次。

1.6 最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定[17]將高壓滅菌后的濾紙片浸入通過(guò)二倍稀釋法制備的濃度分別為25、12.5、6.25、3.125、1.5625 mg/mL的松樹(shù)皮原花青素水溶液中30 min，待其干燥后使用。以無(wú)菌水浸泡的濾紙片作為陰性對(duì)照，青霉素藥敏紙片作為陽(yáng)性對(duì)照，每組做3個(gè)平行試驗(yàn)。以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌為供試菌種，使用1.2.4的方法測(cè)其抑菌圈直徑，取其平均值。觀察結(jié)果以無(wú)抑菌圈的最低溶液濃度為松樹(shù)皮原花青素水溶液的最低抑菌濃度。

1.7 OPC穩(wěn)定性研究

1.7.1 pH對(duì)OPC抑菌活性的影響[18]用1 mol/L HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)0.2 g/mL松樹(shù)皮原花青素溶液的pH值分別為 2、4、6、7、8、10，以相應(yīng) pH 水溶液作為陰性對(duì)照，以青霉素藥品作為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌過(guò)濾，平衡24 h后以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌為供試菌種，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后測(cè)定抑菌圈直徑大小，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7.2 溫度對(duì)OPC穩(wěn)定性的影響[19]將0.2 g/mL OPC分別置于 20℃、40℃、60℃、80℃、100℃水浴條件下處理 1 h。無(wú)菌過(guò)濾后以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌為供試菌種，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后測(cè)定抑菌圈直徑大小，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7.3 紫外線(xiàn)對(duì)OPC穩(wěn)定性的影響[20]將0.2 g/mL OPC 置于 40 w 紫外燈下分別照射 0、15、30、60、90、120 min。無(wú)菌過(guò)濾后以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌為供試菌種，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后測(cè)定抑菌圈直徑大小，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 OPC抑菌活性測(cè)定 由圖1可知，OPC對(duì)革蘭陽(yáng)性有明顯的抑制作用，而對(duì)革蘭陰性菌無(wú)明顯抑制效果。其中OPC對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用最強(qiáng)（P＜0.01），其次是對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用（P＜0.01），而對(duì)大腸埃希菌和銅綠色假單胞菌無(wú)抑制作用。隨著OPC的濃度增大其對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草桿菌的抑制效果也越顯著，當(dāng)OPC濃度達(dá)到200、250 mg/mL時(shí)，抑菌圈的大小基本一致。因此，選取枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌作為實(shí)驗(yàn)的菌種，濃度為200 mg/mL的OPC做后續(xù)的抑菌穩(wěn)定性研究。

圖1 不同藥物濃度對(duì)各種菌的抑菌作用抑菌的內(nèi)直徑為0.6 cm，只有抑菌圈直徑大于0.6 cm 才說(shuō)明有抑菌作用Fig.1 Antimicrobial activity of different OPC concentrations on various bacteriaAntimicrobial inner diameter is 0.6 cm， only inhibition zone diameter that greater than 0.6 cm was described antimicrobial activity

2.2 OPC的最低抑菌濃度（MIC） 由圖2可知，OPC對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度分別為12.5，6.25 mg/ml。OPC對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度高于枯草芽孢桿菌，說(shuō)明OPC對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用比金黃色葡萄球菌強(qiáng)，抑菌效果明顯。

圖2 OPC最低抑菌濃度（MIC）Fig.2 The MIC of OPC against Staphylococcus aureus and Bacillus Sukatilis

2.3 OPC穩(wěn)定性研究

2.3.1 溫度對(duì)OPC抑菌效果的研究 由圖3可知，隨溫度上升，OPC對(duì)枯草桿菌的抑菌效果呈下降趨勢(shì)，在60℃～80℃對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果較好，說(shuō)明溫度對(duì)OPC的抑菌活性有一定的影響。但總體來(lái)說(shuō)，OPC在20℃～100℃范圍內(nèi)處理1 h仍具有較好的抑菌效果，表明OPC具有熱穩(wěn)定性，OPC即使添加于需進(jìn)行加熱處理的藥物中，也可穩(wěn)定保持其抗菌防腐性能。

2.3.2 pH值對(duì)OPC抑菌效果的研究 由圖4可知，pH對(duì)抑菌作用具有顯著的影響，在pH＜6時(shí)，隨pH值的升高，OPC對(duì)2種供試菌的抑菌能力顯著升高。當(dāng)pH＞7時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌革蘭陽(yáng)性菌抑菌能力隨pH的增加而顯著下降?？梢?jiàn)在偏中性pH值范圍內(nèi)，OPC具有較好的抑菌活性。pH升高或降低可能改變了OPC有效抑菌成分結(jié)構(gòu)，而在中性的環(huán)境下OPC的結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，具有較強(qiáng)的抑菌活性。因此OPC作為防腐劑使用，應(yīng)調(diào)節(jié)在中性環(huán)境中使其保持較強(qiáng)的抑菌活性。

圖4 PH對(duì)藥物抑菌作用的影響Fig.4 The antibacterial activity of OPC at different pH

2.3.1 紫外線(xiàn)對(duì)OPC抑菌效果的研究 以金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌為指示菌，研究紫外照射對(duì)松樹(shù)皮原花青素的抑菌活性的影響。由圖5可以看出，經(jīng)紫外線(xiàn)照射后OPC對(duì)兩種菌仍有較好的抑制作用，抑菌效果變化不大，同時(shí)隨照射時(shí)間的延長(zhǎng)，抑菌效果相對(duì)較穩(wěn)定。OPC在紫外線(xiàn)照射下對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用相對(duì)較穩(wěn)定，隨紫外線(xiàn)照射時(shí)間的延長(zhǎng)，照射90 min之后，抑菌作用基本保持不變；而對(duì)枯草芽孢桿菌則隨時(shí)間的延長(zhǎng)抑菌作用逐漸減弱，到90 min之后也基本保持不變。由此看出對(duì)于不同菌種，OPC的抑菌活性具有不同的紫外光穩(wěn)定性，推測(cè)原因?yàn)镺PC對(duì)不同菌種的抑菌機(jī)制存在差異。

圖5 UV對(duì)藥物抑菌作用的影響Fig.5 The impact of UV on the OPC antibacterial

3 討論

本實(shí)驗(yàn)表明對(duì)枯草桿菌的抑制作用最強(qiáng)，其次是金黃色葡萄球菌，此外對(duì)革蘭陰性菌大腸桿菌和綠膿桿菌沒(méi)有抑菌及增菌作用。OPC藥液濃度在150～250 mg/L范圍內(nèi)抑菌作用較強(qiáng)，OPC對(duì)金黃色葡萄球菌的最大抑菌圈直徑可達(dá)12.2 mm、枯草桿菌達(dá)12.0 mm；OPC的抑菌活性均在接近中性條件下效更加穩(wěn)定，經(jīng)加熱其抑菌效果變化不大，仍具有較高的抑菌活性。

原花青素是植物中普遍存在的生物類(lèi)黃酮，在松樹(shù)皮和葡萄籽中表達(dá)含量較高。與我們的研究結(jié)果相似，從蘋(píng)果和葡萄籽中提取的原花青素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌-金黃色葡萄球菌和鏈球菌都有較強(qiáng)的抑制作用，但是溫度、pH值和紫外線(xiàn)對(duì)原花青素抑菌作用的影響并未闡述[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，松樹(shù)皮提取的原花青素對(duì)革蘭氏陰性菌-大腸桿菌和綠膿桿菌的抑制效果較小。但有研究表明，紫甘薯花青素對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)也有抑制作用[22]。我們分析從不同植物中提取的原花青素對(duì)于革蘭氏陰性菌的抑制作用可能有不同。

總體上看，OPC抑菌活性較穩(wěn)定，受環(huán)境因素影響較小， 即使經(jīng)過(guò)食品加工中常見(jiàn)的熱處理工藝，也可保持其良好的抑菌防腐性能。而且近年來(lái)研究報(bào)道原花青素具有抗氧化作用和清除自由基能力、保護(hù)心血管系統(tǒng)的功能、抗輻射作用等作用[23-25]，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

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Study on bacteriostatic activity and stability of pine bark oligomeric proanthocyanidins

BAI Jing,YUAN Qing-shuang, LI Wei-lingΔ

(Department of Biotechnology, Biotechnology Department of Dalian Medical University, Dalian 116044, China)

ObjectiveTo study the bacteriostatic activity and stability of pine bark oligomeric proanthocyanidins.MethodsBy the K-B disk diffusion method, spoilage bacteria as experiment strains, to study the inhibition effects of the pine bark oligomeric proanthocyanidins and the antimicrobial stability under certain temperature, pH, and UV exposure time.ResultsPine bark oligomeric proanthocyanidins had significant inhibitory effect on Gram positive bacteria (Staphylococcus aureus and Bacillus Sukatilis), which had better inhibition effects in the media neutral, but temperature and UV had little influence on the antimicrobial effects. The minimum inhibitory concentration (MIC) of pine bark oligomeric proanthocyanidins against Staphylococcus aureus and Bacillus Sukatilis were 12.5 and 6.25 mg/mL, respective. However, on Gram negative bacteria(Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa) there was no obvious inhibition effects.ConclusionThe pine bark oligomeric proanthocyanidins has significant inhibitory effect on Gram positive bacteria, the inhibitory effect is stronger in the range of pH 6-7 , and the temperature and UV had a little effect on its antibacterial action, which means that the antibacterial action of pine bark oligomeric proanthocyanidins had good stability.

pine bark oligomeric proanthocyanidins; disk diffusion method;bacteriostatic activity;stability; gram negative; gram positive

Q 93

A

1005-1678(2014)02-0055-04

馬尾松樹(shù)皮提取物（pinus massoniana bark extract，PMBE）是從野生馬尾松樹(shù)皮中提取出來(lái)的一種多酚類(lèi)物質(zhì)，其主要成分是由單體、寡聚體和多聚體等天然黃酮組成的原花青素（oligomeric proantho cyanidins，OPC）[1-3]。具有抗氧化、清除自由基、抗炎及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，被廣泛用于保健食品、藥物以及化妝品的生產(chǎn)[4-8]。1961年德國(guó)的Karl等從山楂新鮮果實(shí)的提取物中首次分離得到原花青素，之后人們又相繼在葡萄、花生、銀杏等植物中發(fā)現(xiàn)原花青素，松樹(shù)皮也已被證實(shí)是原花青素的主要來(lái)源[9]。近年來(lái)，人們對(duì)多酚物質(zhì)抑制人類(lèi)病原微生物給予高度的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)葡萄、蘋(píng)果、啤酒花和中國(guó)綠茶中的多酚物質(zhì)可以抑制牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis）的生長(zhǎng)[10]，葡萄酒和植物多酚可抑制幽門(mén)螺桿菌毒素并治療由其導(dǎo)致的疾病[11]；五倍子(Galla Chinensis)多酚提取物對(duì)變異鏈球菌(Streptococcusmutans)有抑制作用[12]。由此可見(jiàn)，多酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)致病微生物也有控制和影響作用[13]。因此本實(shí)驗(yàn)以松樹(shù)皮原花青素為材料，研究了松樹(shù)皮原花青素對(duì)一些常見(jiàn)微生物和病原菌（大腸埃希氏菌、銅綠色假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌）的抑菌作用及溫度、pH值及紫外線(xiàn)對(duì)抑菌作用穩(wěn)定性的影響。此研究為松樹(shù)皮原花青素在抑菌方面開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)，也為今后將松樹(shù)皮原花青素開(kāi)發(fā)成一種天然防腐劑提供實(shí)驗(yàn)參考數(shù)據(jù)。

白晶，女，本科，研究方向:生物技術(shù)，E-mail:435760865@qq.com；李煒玲，通信作者，女，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向：腫瘤藥物化療、腫瘤免疫醫(yī)學(xué)，E-mail：liweiling 2006@hotmail.com。