張文順，石巖

（1. 遼寧中醫(yī)藥大學 研究生學院，遼寧 沈陽 110847；2. 遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110847）

中藥復方益糖康對DN模型大鼠腎臟組織中AGEs、RAGEs影響的實驗研究

張文順1，石巖2Δ

（1. 遼寧中醫(yī)藥大學 研究生學院，遼寧 沈陽 110847；2. 遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110847）

目的觀察中藥復方益糖康對糖尿病腎病大鼠腎皮質(zhì)中晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glyclation end-products，AGEs）及其受體的影響，探討其對糖尿病腎病的防治作用機制。方法采用鏈脲佐菌素（strepotozotocin，STZ）誘導大鼠糖尿病模型，觀察8周時腎臟組織AGEs、RAGE mRNA及蛋白表達的變化，以及經(jīng)中藥復方益糖康干預后的變化。結果糖尿病大鼠8周時，模型大鼠腎臟組織中的AGEs含量顯著高于空白組（P＜0．01），而中藥預防組、中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組大鼠腎臟組織中AGEs含量較模型組顯著下降（P＜0．01）；糖尿病腎病模型組大鼠腎臟組織中糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor of advanced glyclation end-products，RAGE）mRNA表達水平較空白組顯著升高（P＜0．01），而中藥預防組、中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組大鼠腎臟組織中RAGE mRNA表達水平較模型組顯著下調(diào)（P＜0．01）。結論中藥復方益糖康對糖尿病大鼠腎功能的保護作用，與其抑制AGEs/RAGE的激活有關。

糖尿病腎??；晚期糖基化終末產(chǎn)物；糖基化終末產(chǎn)物受體；益糖康

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑與儀器 AGEs含量檢測試劑盒，購自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司。兔抗大鼠RAGE 多克隆抗體購自Cell Signaling。兔抗大鼠GAPDH抗體購自Santa Cruz，HRP標記羊抗兔IgG抗體購自Abcam。RT-PCR試劑盒購自北京全式金生物科技有限公司。引物由北京三博遠志生物技術有限公司代為合成。

主要實驗儀器：VERITI型PCR儀（BIO-RAD），電泳儀（EPS 300，北京六一），凝膠成像分析系統(tǒng)（Tanon-4200 SF，上海天能）。

1.2 糖尿病腎病大鼠模型的構建及分組 SPF級SD大鼠

70只，體重200±20 g。采用隨機數(shù)字法將70只大鼠隨機分為正常組和造模組。除正常組外，其余各組采用高脂高糖飼料聯(lián)合小劑量STZ（42 mg/kg，bw）的方法復制糖尿病大鼠模型，72 h后尾靜脈采血測血糖，隨機血糖≥16.7 mmol/L以上者確定為糖尿病大鼠模型模型復制成功。糖尿病模型成功后按照血糖將造模組大鼠隨機分為5組，分別為模型組、中藥預防組、中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組（予貝那普利）。2周后留取24 h尿，若達到下列條件則認為糖尿病腎病模型成立[6]：①空腹血糖持續(xù)≥16.7 mmol/L；②尿白蛋白排泄率＞20 μg/min；③尿量是正常量的150%。中藥預防組和中藥低劑量組按照正常成人劑量（g/Kg）的6.3倍給藥，中藥預防組自糖尿病造模成功開始即給藥；中藥高劑量組按照低劑量的3倍給藥；西藥組給藥量按照正常成人給藥量等效換算成年大鼠給藥量，即0.9 mg/（Kg·d）。

1.3 指標檢測

1.3.1 各組大鼠腎臟組織中AGEs含量檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）法檢測各組大鼠腎臟組織中AGEs含量。取各組大鼠腎臟皮質(zhì)100 mg置于2 mL玻璃勻漿器中，加入1 mL冷的PBS緩沖液，于冰上進行勻漿，收集勻漿液于2 mL離心管中，4℃離心機中，2000 r/min，離心10 min，吸取上清液用于AGEs含量檢測，檢測方法嚴格按照試劑盒中說明書操作步驟進行。

1.3.2 各組大鼠腎臟組織中RAGE表達水平檢測 采用Western-bloting方法對各組大鼠腎臟組織中RAGE表達水平進行檢測。稱取腎臟皮質(zhì)100 mg，按照組織凈重與裂解液1：10的比例加入蛋白提取試劑，并用玻璃勻漿器在冰上進行勻漿，勻漿后靜置于冰上20 min，10000 r/min進行離心，離心15 min，分離上清液即為總蛋白備用。采用考馬斯亮藍法對各組總蛋白進行蛋白定量，每孔上樣20 μg總蛋白進行電泳，半干轉印法將蛋白轉至 PVDF 膜，一抗（1∶500）4℃孵育過夜、二抗（1∶1000）室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜3次，用吸水紙吸干PVDF膜上的殘液，加ECL發(fā)光液1 mL，置于凝膠成像分析系統(tǒng)中采集圖像，并測定目的蛋白條帶和內(nèi)參條帶的灰度值，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參條帶灰度值比值作為統(tǒng)計數(shù)據(jù)，進行RAGE表達水平分析。

1.3.3 各組大鼠腎臟組織中RAGE mRNA表達水平檢測 采用RT-P C R方法對各組大鼠腎臟組織中RAGE mRNA表達水平進行檢測：RAGE上游引：5’-GGCCTTCCTCGGCGCAGAC-3’；下游引物：5’-TAGA TGCCCTCATCCTCATGC-3’，擴增片段長度 260 bp。內(nèi)參β-actin上游引物：5’-CGTAAAGACCTCTATGC CAA-3’；下游引物：5’-AGCCATGCCAAATGTGTCAT-3’，擴增片段長度349 bp。凝膠成像分析系統(tǒng)采集圖像，并測定目的基因條帶和內(nèi)參基因條帶的積分光密度值，以目的條帶積分光密度值/內(nèi)參基因積分光密度值的比值作為統(tǒng)計數(shù)據(jù)，進行RAGE mRNA表達水平分析。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 10.0軟件對各組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，正態(tài)計量數(shù)據(jù)用“±s”表示，并采用單因素方差分析數(shù)據(jù)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 益糖康對糖尿病大鼠腎臟組織中AGEs含量影響 糖尿病腎病模型大鼠腎臟組織中的AGEs含量為（763.75±47.34）ng/g 組織，顯著高于空白組（P＜0.01）；與模型組比較，中藥預防組、中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組大鼠腎臟組織中AGEs含量均顯著下降（P＜0.01，見表1）。

表1 大鼠腎臟組織中AGEs含量測定Tab.1 Measurement of AGEs content in rat kidney

*P＜0.01，與空白組比較，compared with blank group；﹟P＜0.01，與模型組比較，compared with model group；△P＜0.01，與西藥組比較，compared with western medicine group。

2.2 益糖康對糖尿病大鼠腎臟組織中RAGE mRNA及蛋白表達影響 與空白組比較，DN模型組大鼠腎臟組織中RAGE mRNA表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥預防組、中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組大鼠腎臟組織中RAGE mRNA表達水平顯著下調(diào)（P＜0.01，見圖1、圖2）。

圖1 益糖康對DN模型大鼠腎臟組織中RAGE mRNA表達水平影響**P＜0.01，與空白組相比；＃＃P＜0.01，模型組相比；△△P＜0.01，與西藥組相比Fig.1 The effect of Chinese herbal compound Yitangkang extract on renal RAGE mRNA in rats with diabetic nephropathy**P＜0.01，compared with blank group；＃＃P＜0.01，compared with model group；△△P＜0.01，compared with western medicine group

圖2 益糖康對DN模型大鼠腎臟組織中RAGE mRNA表達水平的影響M. marker；1. 空白組；2. 模型組；3. 中藥預防組；4. 中藥低劑量組；5. 中藥高劑量組；6. 西藥組Fig.2 The effect of Chinese herbal compound Yitangkang extract on expression of renal RAGE mRNA in rats with diabetic nephropathyM. marker；1. blank group；2. model group；3. prevent group；4. low dose group；5. high dose group；6. western medicine group

2.3 益糖康對糖尿病大鼠腎臟組織中RAGE蛋白表達影響 與空白組比較，DN模型組大鼠腎臟組織中RAGE表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥預防組、中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組大鼠腎臟組織中RAGE表達水平顯著下調(diào)（P＜0.01，見圖 3、圖 4）。

圖3 益糖康對DN模型大鼠腎臟組織中RAGE蛋白表達水平影響*P＜0.05，**P＜0.01與空白組相比；＃＃P＜0.01，模型組相比；△△P＜0.01，與西藥組相比Fig.3 The effect of Chinese herbal compound Yitangkang extract on renal RAGE in rats with diabetic nephropathy*P＜0.05，**P＜0.01 compared with blank group；＃＃P＜0.01， compared with model group；△△P＜0.01，compared with western medicine group

圖4 益糖康對DN模型大鼠腎臟組織中RAGE蛋白表達水平的影響1. 空白組；2. 模型組；3. 中藥預防組；4. 中藥低劑量組；5. 中藥高劑量組；6. 西藥組Fig.4 The effect of Chinese herbal compound Yitangkang extract on expression of renal RAGE in rats with diabetic nephropathy1. blank group；2. model group；3. prevent group；4. low dose group；5. high dose group；6. western medicine group

3 討論

DN的病理學改變包括腎小球肥大、系膜基質(zhì)增生，腎小球基底膜增厚以及最終發(fā)生的腎小球硬化。AGE是糖尿病時許多組織蛋白質(zhì)、氨基酸、脂質(zhì)或核酸等大分子物質(zhì)的游離氨基在無酶參與條件下與還原糖的醛基或酮基反應而產(chǎn)生的一種穩(wěn)定的化合物。其在糖尿病腎病的發(fā)病機制中起著重要作用，是引起腎臟直接損傷以及通過RAGE信號通路而引起腎臟病變的主要物質(zhì)基礎[7]。糖尿病慢性并發(fā)癥的關鍵因素是由于AGEs及其前體物質(zhì)的蓄積，而腎臟的AGEs及其前體物質(zhì)又直接引起腎小球毛細血管結構、功能的改變[8]，參與了DN的發(fā)生發(fā)展。AGEs與細胞表面的RAGE結合后，激活RAGE并作為信號轉導受體激活細胞內(nèi)各種信號轉導通路，從而導致了細胞功能紊亂，使腎小球產(chǎn)生各種細胞外基質(zhì)成分，引起腎臟組織增生，導致腎小球的硬化[9-11]。

許惠琴等[12]通過研究山茱萸環(huán)烯醚萜苷，發(fā)現(xiàn)下調(diào)糖尿病血管病變大鼠腎組織RAGE及TGF-βmRNA的表達，能夠保護血管內(nèi)皮，進而抗腎小球內(nèi)基質(zhì)的增生及基底膜增厚等作用。馬建等[13-15]通過實驗研究，降低腎組織AGES含量，抑制TGF-β 1、RAGEs mRNA、RAGE的表達，可以改善DN腎臟基質(zhì)增生、系膜區(qū)增寬的病理結構，減輕腎小球硬化，改善腎功能，對DN起到治療作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病大鼠模型腎皮質(zhì)中均有AGEs生成，尤以模型組最為顯著，且各給藥組對糖尿病腎病大鼠的腎皮質(zhì)中AGEs含量具有顯著下調(diào)的作用，與模型組比較(P＜0.01)。通過本實驗觀察，不同濃度的復方益糖康可顯著下調(diào)腎臟組織中RAGE的mRNA及RAGE蛋白表達水平，與模型組比較(P＜0.01)；中藥高劑量組與西藥組比較無顯著差異，中藥預防組與西藥組比較(P＜0.01)。說明益糖康可能通過抑制AGEs/RAGE的激活，從而調(diào)節(jié)腎血流量，有保護血管內(nèi)皮，抗腎小球內(nèi)基質(zhì)增生而起到改善或延緩糖尿病時腎臟病變的發(fā)生和發(fā)展的作用，這可能是中藥復方益糖康防治糖尿病腎病的作用機制之一。

[1] 李澤光，張彥文，黃吉峰．復方益糖康對AGEs體外誘導HMC細胞凋亡的影響[J]．中醫(yī)藥信息，2012，29（4）：63-65．

[2] Alikhani M,Maclellan C,Raptis M,et al．Advanced glycation endproducts induce apoptosis in fibroblasts through activation of ROS MAP Kinases and FOXO 1 transcription factor[J]．Am J Physiol Cell Physiol,2007,292(2)：C 850-C 856．

[3] 張冰冰，石巖．中藥復方益糖康對糖尿病大鼠白色脂肪中脂聯(lián)素、脂聯(lián)素受體1基因表達的影響[J]．中華中醫(yī)藥雜志，2011，26（8）：1825-1827．

[4] 楊宇峰，滕飛，石巖．中藥益糖康干預并有糖調(diào)節(jié)受損的代謝綜合征臨床研究[J]．中華中醫(yī)藥學刊，2012，30（11）：2046-2048．

[5] 陳紅謹，石巖，楊宇峰,等．從血壓分層的角度觀察益糖康對痰熱互結型并有IGR的代謝綜合征患者的臨床療效[J]．遼寧中醫(yī)雜志，2012，39（11）：2173-2175．

[6] 沈嵐，俞立強，熊佩華．六味地黃湯合黃連解毒湯對糖尿病腎病大鼠的腎臟保護作用及相關機制[J]．南京中醫(yī)藥大學學報，2013，29（6）：553-556．

[7] 農(nóng)偉虎，許惠琴．糖基化終末產(chǎn)物與糖尿病腎病產(chǎn)生機制的研究進展[J]．南京中醫(yī)藥大學學報，2012，28（2）：195-197．

[8] Gohda T,Tanimoto M,Moon JY．Increased serum endogenous secretory receptor for advanced glycation end-product (esRAGE) levels in type 2 diabetic patients with decreased renal function[J]．Diabetes Res Clin Pract，2008,81(2)：196-201．

[9] Wautier MP,Chappey O,Corda S,et al．Activation of NADPH oxidase by AGE links oxidant stress to altered gene expression via RAGE[J]．Am J Physiol Endoccrinol Metab,2001,280(5)：685-694．

[10] Yeh CH,Sturgis L,Haidacher J,et al．Requirement for p 38 and p 44/42 mitogen activated protein kinases in RAGE-mediated nuclear factor-κB transcriptional activation and cytokine secretion [J]．Diabetes,2001,50(6)：1495-1504．

[11] Pankewycz OG,Guan JX,Bolton WK,et al．Renal TGF-β regulation in spontaneously diabetic NOD mice with correlation in mesangial cells[J]．Kidney Int,1994,46(3)：748-758．

[12] 許惠琴，郝海平，皮文霞，等．山茱萸環(huán)烯醚萜總苷對糖尿病大鼠腎皮質(zhì)糖化終產(chǎn)物及其受體mRNA表達的影響[J]．中藥藥理與臨床，2003，19（4）：9-12．

[13] 馬建，程妍，崔淑玟，等．糖腎康飲對糖尿病腎病大鼠腎組織 AGES和TGF-β1表達的影響[J]．中醫(yī)藥信息，2012，29（6）：37-40．

[14] 王小琴，唐慶，馬俊，等．腎安提取液對糖尿病腎病模型小鼠腎臟AGEs、RAGEs的影響[J]．湖北中醫(yī)學院學報，2010，12（5）：3-5．

[15] 李青，王耀獻，饒容麗，等．益氣養(yǎng)陰活血法對糖尿病腎病大鼠腎皮質(zhì)AGEs及其受體的影響[J]．北京中醫(yī)藥大學學報，2010，33（7）：464-467．

The effect of Chinese herbal compound Yitangkang extract on expression of renal AGEs and RAGEs in rats with diabetic nephropathy

ZHANG Wen-shun1，SHI Yan2Δ
( 1. Graduate School, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110847, China；2. Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847, China)

ObjectiveTo observe the effect of Chinese herbal compound Yitangkang on the expressions of advanced glyclation endproducts (AGEs) and the receptor of advanced glyclation end-products mRNA(RAGE-mRNA) in rats with diabetic nephropathy(DN)，and to discuss the mechanism of the formulas in the treatment of DN.MethodsThe rat model of DN were established by intraperitoneal injection of strepotozotocin(STZ). After 8 weeks intervention with medications, the expression of renal RAGEs mRNA was detected by Real-time PCR, renal RAGE by immunohistochemistry, and renal content of AGEs by spectrophotometry.ResultsCompared with normal control group, the expression of renal RAGEs mRNA and RAGEs in diabetic nephropathy rats were increased significantly(P＜0.01). Compared with DN group, the expression of renal RAGEs mRNA and RAGEs in three doses Yitangkang groups and western medicine group were decreased significantly(P＜0.01).ConclusionChinese herbal compound Yitangkang could protect kidney of diabetic nephropathy rats,and the mechanism is related to its loweirng renal expression of RAGEs mRNA, RAGEs and AGEs content.

diabetic nephropathy; advanced glyclation end-products; receptor of advanced glyclation end-products; Yitangkang

R 285．5

A

1005-1678(2014)02-0045-03

隨著糖尿病患病率的不斷增高，糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）發(fā)病率也呈現(xiàn)出逐年上升趨勢。DN的發(fā)病機制是多種因子相互作用的過程，其中晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)在糖尿病腎病的發(fā)生與進展中起重要作用[1]，另有報道AGE與AGE受體蛋白（RAGE）的結合是通過促進ROS的合成從而導致了成纖維細胞和神經(jīng)元細胞的凋亡[2]，進而引發(fā)糖尿病腎病。中藥復方“益糖康”是以國家中藥保護品種“降糖丹”為基礎研制的，其治療糖尿病經(jīng)過多年的臨床應用，取得了令人滿意的療效[3-5]，故本實驗利用鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導糖尿病大鼠模型，觀察中藥復方益糖康對腎臟組織中AGEs及其受體的調(diào)控，進一步探討其對糖尿病腎病的防治作用機制。

遼寧省科技計劃項目（2011408004）

張文順，男，博士，講師，研究方向：糖尿病臨床與實驗研究，E-mail：wenshunzhang@163.com；石巖，通信作者，男，博士，教授，研究方向：糖尿病臨床與實驗研究，E-mail：shiyan@lnutcm.edu.cn。