張勤良，關(guān)琪

（1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院 肛腸科，遼寧 沈陽(yáng) 110024；2.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧 沈陽(yáng) 110024）

海藻玉壺湯對(duì)甲狀腺癌荷瘤小鼠趨化因子受體CXCR4的影響研究

張勤良1，關(guān)琪2Δ

（1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院 肛腸科，遼寧 沈陽(yáng) 110024；2.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧 沈陽(yáng) 110024）

目的研究海藻玉壺湯對(duì)荷瘤小鼠實(shí)體瘤中趨化因子受體CXCR4表達(dá)的影響。方法體外培養(yǎng)人甲狀腺癌TT細(xì)胞，接種健康BALB/c小鼠30只，荷瘤成功后給予海藻玉壺湯治療，實(shí)驗(yàn)分組為：荷瘤對(duì)照組（n=10），海藻玉壺湯高劑量組（n=10）及海藻玉壺湯低劑量組（n=10），觀察小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況計(jì)算抑瘤率。取實(shí)體瘤后，免疫組化法檢測(cè)趨化因子受體CXCR4的表達(dá)，利用實(shí)時(shí)定量PCR（real time polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)CXCR 4 mRNA的表達(dá)。結(jié)果同荷瘤對(duì)照組相比，海藻玉壺湯高低劑量組在蛋白和基因?qū)哟紊辖档土粟吇蜃邮荏wCXCR4的表達(dá)，該影響對(duì)濃度呈一定的依賴性。結(jié)論海藻玉壺湯可降低趨化因子受體CXCR4的表達(dá)。

海藻玉壺湯；CXCR 4；人甲狀腺癌細(xì)胞；BALB/c小鼠

1.2 方法

1.2.1 海藻玉壺湯煎劑的制備 根據(jù)2010年《中華人民共和國(guó)藥典》中規(guī)定海藻玉壺湯的用藥劑量，海藻30 g，昆布15 g，貝母15 g，法半夏10 g，獨(dú)活10 g，青皮5 g，陳皮10 g，當(dāng)歸10 g，川芎10 g，連翹10 g，甘草10 g，海帶5 g配伍后加10倍水浸泡過(guò)夜，按照生藥5.82 g/kg（高劑量）、生藥1.46 g/kg（低劑量）煎煮3次，每次30 min，過(guò)濾，濃縮至每1 mL含生藥1 g的水煮液，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 動(dòng)物分組與處理 BALB/c小鼠30只，按照隨機(jī)數(shù)字表分成3組，實(shí)驗(yàn)分組為：荷瘤對(duì)照組（n=10），海藻玉壺湯低劑量組（n=10）及海藻玉壺湯高劑量組（n=10），小鼠均于背部注射甲狀腺癌TT細(xì)胞懸液0.1 mL（約2×106個(gè)），4 w后成瘤開(kāi)始用藥。荷瘤對(duì)照組予生理鹽水灌胃，0.5 mL/只，日2次；海藻玉壺湯低劑量組予低劑量海藻玉壺湯灌胃，0.5 mL/只，日2次；海藻玉壺湯高劑量組予高劑量海藻玉壺湯灌胃，0.5 mL/只，日2次。小鼠成瘤后，1周2次觀察接種腫瘤的生長(zhǎng)并用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤結(jié)節(jié)的最長(zhǎng)徑a和最短徑b，根據(jù)公式計(jì)算腫瘤體積：V(mm 3)=1/6 π(ab2)。用藥3周后，處死小鼠，剝離實(shí)體瘤，稱量濕重，根據(jù)公式計(jì)算抑瘤率：腫瘤抑瘤率（%）=[1-（平均實(shí)驗(yàn)組瘤重/平均對(duì)照組瘤重）]×100%。

1.2.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CXCR4蛋白表達(dá) 將造模后BALB/c小鼠的瘤組織，經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5μm。切片脫蠟至水。滴加5%BSA封閉液，室溫10 min。甩去多余液體，不洗。滴加兔抗鼠CXCR4抗體，4℃冰箱中過(guò)夜，PBS（pH 7.2～pH 7.6）洗 2 min×3 次。滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃ 20 min。PBS洗2 min×3次。滴加試劑SABC，20℃～37℃20 min。PBS洗5 min×4次。DAB顯色，光鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，蒸餾水洗滌。蘇木素輕度復(fù)染。顯微鏡下拍照觀察。用Quantity One圖像分析軟件進(jìn)行分析，以細(xì)胞漿/膜或核中出現(xiàn)粗細(xì)一致的棕黃色顆粒作為陽(yáng)性，隨機(jī)取5個(gè)視野，在400倍高倍鏡下，計(jì)數(shù)細(xì)胞，測(cè)出陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞的總面積和積分光密度，求出平均光密度。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá) 取冷凍保存的實(shí)體瘤組織 0.1～0.2 g，采用 Tr i z o l法提取組織RNA，按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。CXCR4引物序列：上游引物 5'-GGAGGGGATCAGTATATACA-3'，下游引物5'-GAAGATGGAGTAGATGG-3'，145 bp；內(nèi)參序列：上游引物5'-GAAGGTCAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'，226 bp；25 μL 反應(yīng)體系，預(yù)變性94℃1 min，退火60℃1 min，延伸72℃2 min，循環(huán)35次。余按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，用反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度與內(nèi)參的比值表示該基因表達(dá)強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)計(jì)量資料用“±s”表示，組間比較用采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 海藻玉壺湯對(duì)小鼠腫瘤的影響 與同期未治療的荷瘤對(duì)照組小鼠比較，經(jīng)海藻玉壺湯治療后的小鼠出現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)減緩現(xiàn)象（見(jiàn)圖1）。取材后稱取瘤重可知，荷瘤對(duì)照組小鼠瘤重為（2.16±0.78）g，海藻玉壺湯高劑量組小鼠瘤重為（1.49±0.56）g，抑瘤率為31.0%；海藻玉壺湯低劑量組小鼠瘤重為（1.26±0.77）g，抑瘤率為 41.7%。

圖1 不同組別腫瘤的體積Fig.1 Tumor volume of different groups

2.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CXCR4表達(dá) 荷瘤對(duì)照組CXCR4蛋白表達(dá)較多，呈深棕色。海藻玉壺湯高低劑量組腫瘤細(xì)胞胞膜及胞漿上CXCR4蛋白表達(dá)較少。通過(guò)計(jì)算AOD值可知，海藻玉壺湯低劑量組和海藻玉壺湯高劑量組同荷瘤對(duì)照組相比，CXCR4蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05），海藻玉壺湯高劑量組同海藻玉壺湯低劑量組相比，CXCR4蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05，見(jiàn)圖 2、表 1）。

圖2 不同組CXCR4蛋白的表達(dá)（×400）Fig.2 The expression of different groups of CXCR 4 protein(×400)

表1 CXCR4蛋白表達(dá)的AOD值Tab.1 AOD for CXCR 4 expression

2.3 RT-PCR檢測(cè)CXCR4 mRNA的表達(dá) 采用RTPCR方法檢測(cè)CXCR4 mRNA表達(dá)，海藻玉壺湯高、低劑量組mRNA同荷瘤對(duì)照組相比，表達(dá)均顯著降低（P＜0.05），但海藻玉壺湯高低劑量組之間無(wú)顯著差異（見(jiàn)圖3）。

Fig.3 mRNA expression of CXCR 4 detected by RT-PCR*P＜0.05， compared with tumor-bearing mice control group

3 討論

趨化因子由一系列分子量為8～12 kDa的分泌型小分子多肽組成的家族[4-6]，由1992年第二屆關(guān)于趨化作用細(xì)胞因子討論大會(huì)上命名，屬跨膜G蛋白偶聯(lián)受體超家族，參與多種生理和病理過(guò)程。趨化因子受體CXCR4在惡性腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中有重要作用，與惡性腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[7-9]。祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，無(wú)甲狀腺癌一類名詞，辯證當(dāng)屬“癭瘤”?！锻饪普?癭瘤論》云：“夫人生癭瘤之癥，非陰陽(yáng)正氣結(jié)腫，乃五臟瘀血、濁氣、痰滯而成”[10-11]?！锻饪拼蟪伞芬嘣疲骸胺虬`瘤者，由五臟邪火濁氣，瘀血痰滯，各有所感而成。”對(duì)其治療，提出了經(jīng)典方藥海藻玉壺湯[12-13]。大量實(shí)踐也表明類似海藻玉壺湯以益氣養(yǎng)血、軟堅(jiān)散結(jié)兼活血化瘀的中藥對(duì)甲狀腺癌患者，在臨床癥狀方面具有一定效果，同時(shí)可以降低血清甲狀腺球蛋白水平[14-15]，本實(shí)驗(yàn)主要建立甲狀腺癌TT細(xì)胞裸鼠模型，探究該經(jīng)典復(fù)方對(duì)甲狀腺癌療效的影響，為研究作用機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。由結(jié)果可以看出，海藻玉壺湯能夠使小鼠出現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)減緩現(xiàn)象，并且降低趨化因子受體CXCR4的表達(dá)。其中蛋白水平上，海藻玉壺湯高劑量組效果優(yōu)于海藻玉壺湯低劑量組（P＜0.05），而基因水平上二者相差不大。這說(shuō)明，海藻玉壺湯對(duì)甲狀腺癌的抑制作用，這與王業(yè)生[16]等人研究結(jié)論一致，可能與改變趨化因子受體CXCR4的表達(dá)有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Effects of Haizao Yuhu Decoction on chemokine receptor CXCR4 in TT cell tumor-bearing mice

ZHANG Qin-liang1, GUAN Qi2Δ
(1.Department of Anorectal Disease, Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College, Shenyang 110024 China;2.Department of Medical Laboratory, Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College, Shenyang 110024, China)

ObjectiveTo observe the effects of Haizao Yuhu Decoction on the CXCR 4 expression of TT cell tumor-bearing mice.MethodsCulture the human thyroid TT cells in vitro, and inoculate them into 30 healthy mice BALB/C. Subsequently, Haizao Yuhu Decoction was given to the tumor-bearing mice. They are grouped into three groups, including tumor-bearing group (n=10), Haizao Yuhu Decoction high dosage group(n=10) and Haizao Yuhu Decoction low dosage group (n=10) to observe the tumor growth to calculate the anti-tumor rate. After the tumor has been reaped, immunohistochemical is adopted to test the expressions of chemotactic factor receptor—CXCR 4 on protein level. RT-PCR is used to test the expressions of CXCR 4 on genetic level.ResultsComparing with the tumor-bearing group, HZYHD high-dosage group has decreased the expressions of CXCR 4 on both the protein and genetic levels, which is to certain degree dependent on concentration.ConclusionHaizao Yuhu Decoction could decrease the expression of CXCR 4.

HaizaoYuhu Decoction;CXCR 4;TT cell;BALB/c mice

R 453．9

A

1005-1678(2014)02-0042-03

海藻玉壺湯出自《外科正宗》，由海藻、貝母、陳皮、青皮、昆布等12味中藥組成，是傳統(tǒng)治療癭病之方，廣泛應(yīng)用于以瘰疬為主要臨床特征的疾病[1-2]。趨化因子（chemoattractant cytokines，CK）是指機(jī)體內(nèi)一群能使細(xì)胞發(fā)生趨化運(yùn)動(dòng)的小分子細(xì)胞因子，在抗感染和免疫中起關(guān)鍵性作用。已有研究證明[3]，趨化因子的家族成員CXCR4，同在多種惡性腫瘤中表達(dá)相關(guān)，特別是在甲狀腺癌中有很高的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率，隨著病理分化程度的降低，強(qiáng)陽(yáng)性的表達(dá)率逐漸升高。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立甲狀腺癌TT細(xì)胞荷瘤小鼠模型，通過(guò)不同濃度海藻玉壺湯對(duì)其進(jìn)行處理，觀察小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況，計(jì)算抑瘤率，并通過(guò)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)實(shí)體瘤上趨化因子CXCR4表達(dá)情況，探究該經(jīng)典復(fù)方對(duì)甲狀腺癌療效的影響，為研究該方藥的作用機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 甲狀腺癌TT細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究中心（北京）；SPF級(jí)BALB/c小鼠30只，雌雄各半購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)：scxk（京）2011-0011；胎牛血清購(gòu)于Hyclone（貨號(hào)：SH 30084.03）；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于北京鼎國(guó)（貨號(hào)：CC 0031）；RIPA裂解液購(gòu)于北京鼎國(guó)（貨號(hào)：WB-0071）；海藻玉壺湯材購(gòu)自北京同仁堂藥店；熒光定量PCR儀購(gòu)于ABI公司（9700型）。

遼寧省自然科學(xué)基金（201102150）

張勤良，男，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療肛門(mén)結(jié)腸病基礎(chǔ)和臨床，E-mail：zql_1681@163.com；關(guān)琪，通信作者，男，博士，主任檢驗(yàn)師，研究方向：抗腫瘤及抗病毒免疫，E-mail：guanqi 1231@sina.com。