孫平，侯東彬

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院，湖北 武漢 430070）

紫杉醇聯(lián)合金雀異黃素用于肺癌細(xì)胞的抑制效果評估

孫平，侯東彬Δ

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院，湖北 武漢 430070）

目的探討紫杉醇（paclitaxel，PTX）聯(lián)合金雀異黃素對肺癌細(xì)胞的抑制作用。方法將肺癌A549細(xì)胞隨機(jī)分為生理鹽水組、紫杉醇干預(yù)組、金雀異黃素干預(yù)組和聯(lián)合干預(yù)組。MTT法研究紫杉醇聯(lián)合金雀異黃素對肺癌A 549細(xì)胞的增殖抑制情況。流式細(xì)胞術(shù)檢測給藥后腫瘤細(xì)胞凋亡情況。建立A 549肺癌裸鼠移植瘤模型，計(jì)算抑瘤率。結(jié)果肺癌A 549細(xì)胞給藥48 h后，紫杉醇干預(yù)組、金雀異黃素干預(yù)組和聯(lián)合干預(yù)組對腫瘤細(xì)胞的抑制率分別為（57．0±4．5）%、（34．0±4．6）%和（77．0±4．4）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）；紫杉醇干預(yù)組、金雀異黃素干預(yù)組和聯(lián)合干預(yù)組凋亡率分別為63．4%、41．2%和84．5%，而生理鹽水組凋亡率為7．6%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）；荷瘤小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比于生理鹽水組，金雀異黃素組、紫杉醇組和聯(lián)合干預(yù)組對腫瘤生長的抑制率分別為（18．2±3．4）%、（32．1±4．2）%和（63．4±5．1）%，聯(lián)合干預(yù)組與其他單獨(dú)給藥組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。結(jié)論紫杉醇與金雀異黃素均具有抑制肺癌細(xì)胞增殖的作用，2者聯(lián)用能夠發(fā)揮協(xié)同作用，增強(qiáng)抗腫瘤能力。

紫杉醇；金雀異黃素；肺癌細(xì)胞；聯(lián)合

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清購自浙江四季青生物科技有限公司；金雀異黃素購自美國sigma公司，批號：G 131208；DMEM培養(yǎng)基購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司；MTT試劑盒購自sigma公司；紫杉醇購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，（批號：S121105）；其余試劑為分析純。A549人源性肺癌細(xì)胞購自上海細(xì)胞研究所；雄性裸鼠（20～25 g）購自山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，動物許可證號：SDDX 201308231。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將A549細(xì)胞置于含有100 mg/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%CO2，濕度為13.5%，溫度為37℃。待細(xì)胞匯合度為0.8～0.9時，用2.5 mg/L胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn)考察不同藥物干預(yù)對A549的增殖抑制作用 培養(yǎng)A549細(xì)胞接種于96孔板中，隨機(jī)分為生理鹽水組、紫杉醇干預(yù)組、金雀異黃素干預(yù)組和聯(lián)合干預(yù)組。當(dāng)孔板中細(xì)胞完全貼壁且處于對數(shù)生長期時，分別加入無菌過濾后的紫杉醇（3 μg/mL）、金雀異黃素（3 μg/mL）、紫杉醇+金雀異黃素(紫杉醇，3 μg/mL＋金雀異黃素，3 μg/mL)各 20 μL。將孔板移入37℃ CO2孵箱中培養(yǎng)24 h和48 h后取出，每孔加入20 μl 5 mg/mL MTT溶液，再放回孵箱中繼續(xù)孵育4h，將孔板中液體倒出，每孔加入200 μL DMSO，37℃避光振搖15 min，用酶標(biāo)儀在490 nm處測定各孔的光密度值（OD）。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 培養(yǎng)A549細(xì)胞接種于96孔板中，當(dāng)孔板中細(xì)胞完全貼壁且處于對數(shù)生長期時加入無菌過濾后的紫杉醇（3 μg/mL）、金雀異黃素（3 μg/mL）、紫杉醇+金雀異黃素(紫杉醇，3 μg/mL +金雀異黃素，3 μg/mL)各20 μL。將孔板移入37℃CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后將A549細(xì)胞給藥孵育24 h，然后用冰PBS清洗細(xì)胞3次，F(xiàn)ITC/PI雙染，細(xì)胞避光放置15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡數(shù)量。

1.2.4 肺癌異位腫瘤模型的建立 A549細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，離心后將其懸浮于DMEM培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)調(diào)節(jié)濃度至5×107個/mL。取4～6周齡，體重20～25 g的雄性裸鼠，將準(zhǔn)備好的A549細(xì)胞懸濁液皮下接種于裸鼠背部，每只裸鼠接種0.1 mL細(xì)胞懸濁液。接種后1～2周可見背部長出腫瘤塊，證明接種成功。將優(yōu)選后的24只荷瘤裸鼠隨機(jī)分成4組：生理鹽水組、紫杉醇干預(yù)組（20 mg/kg）、金雀異黃素干預(yù)組（20 mg/kg）和紫杉醇（10mg/kg）+金雀異黃素（10 mg/kg）組。各組均采用腹腔注射給藥，第21天處死小鼠，剖腫瘤，稱重。取腫瘤切片，按照試劑盒提供的說明書進(jìn)行TUNEL染色檢測。

2 結(jié)果

2.1 對A549腫瘤細(xì)胞增殖的影響 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紫杉醇和金雀異黃素均能抑制A549肺癌細(xì)胞的增殖。當(dāng)紫杉醇和金雀異黃素聯(lián)合用藥時對腫瘤細(xì)胞的抑制能力大于單獨(dú)用藥。給藥48 h后，紫杉醇干預(yù)組、金雀異黃素干預(yù)組和聯(lián)合干預(yù)組對腫瘤細(xì)胞的抑制率分別為（57.0±4.5）%、（34.0±4.6）%和（77.0±4.4）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與生理鹽水組相比，單獨(dú)給藥組和聯(lián)合給藥組均能有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，見表 1）。

表1 不同干預(yù)方法對肺癌細(xì)胞的增殖抑制率（%）Tab.1 The inhibition rate of A549 cell by different treatments at 24 h and 48(%)

2.2 對A549腫瘤細(xì)胞凋亡的影響 體外研究藥物誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紫杉醇、金雀異黃素和聯(lián)合給藥都能不同程度誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。紫杉醇、金雀異黃素和聯(lián)合給藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡率分別為63.4%、41.2%和84.5%，而生理鹽水組凋亡率為7.6%。與生理鹽水組相比，單獨(dú)給藥組和聯(lián)合給藥組均能有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與紫杉醇和金雀異黃素單獨(dú)給藥相比，聯(lián)合給藥能夠增強(qiáng)藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，見圖1）。

圖1 不同藥物干預(yù)誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡

2.3 對皮下移植腫瘤的影響 對荷瘤小鼠的治療實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生理鹽水組腫瘤體積生長速度快，金雀異黃素組、紫杉醇組和聯(lián)合干預(yù)組腫瘤生長依次減慢。相比于生理鹽水組，金雀異黃素組、紫杉醇組和聯(lián)合干預(yù)組對腫瘤生長的抑制率分別為（18.2±3.4）%、（32.1±4.2）%和（63.4±5.1）%，聯(lián)合干預(yù)組與其他單獨(dú)給藥組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，見表1）。各組裸鼠腫瘤組織切片后TUNEL染色，棕色代表凋亡的腫瘤細(xì)胞，圖2可見，聯(lián)合干預(yù)組誘導(dǎo)凋亡的腫瘤細(xì)胞最多，其次是紫杉醇干預(yù)組和金雀異黃素干預(yù)組。

表2 不同干預(yù)方法對肺癌移植瘤的抑制率Tab.2 The inhibition rate of tumor in A549 bearing nude mice by different treatments

圖2 腫瘤組織切片TUNEL染色（×200）Fig.2 HE stained tumor tissues(×200)

3 討論

肺癌是全球最普遍發(fā)生的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率居全球惡性腫瘤之首[10]。當(dāng)前肺癌治療效果不理想，其主要原因是早期診斷率不高，大多數(shù)患者被確診為肺癌時已是中晚期或出現(xiàn)了遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。因此研究新的肺癌治療方法顯得十分重要。紫杉醇是臨床常用的細(xì)胞毒類抗腫瘤藥物。金雀異黃素是已經(jīng)被報道對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，金雀異黃素是一種低毒、高效的抗癌成分，對腫瘤細(xì)胞具有多靶點(diǎn)的抑制作用[11-13]。目前國內(nèi)外尚未見到金雀異黃素與化療藥物聯(lián)合作用于肺癌的報道。

本研究將臨床上已經(jīng)證實(shí)的抗腫瘤藥物紫杉醇與金雀異黃素聯(lián)合使用，結(jié)果顯示：紫杉醇與金雀異黃素聯(lián)合使用能夠顯著抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖。很多藥物通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，結(jié)果顯示聯(lián)合用藥對于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力顯著強(qiáng)于紫杉醇或者金雀異黃素單獨(dú)給藥，說明紫杉醇和金雀異黃素聯(lián)合給藥能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞凋亡起到協(xié)同作用。此外，還通過體內(nèi)腫瘤異位模型考察了聯(lián)合給藥對腫瘤生長的抑制能力，結(jié)果與體外研究結(jié)果相一致。綜上所述，紫杉醇和金雀異黃素聯(lián)合使用能夠有效抑制肺癌的發(fā)展，是一種潛在的肺癌治療手段。對于金雀異黃素抑制腫瘤的機(jī)制可能與其阻斷腫瘤細(xì)胞β-catenin信號途徑，下調(diào)β-catenin核表達(dá)，上調(diào)其胞膜表達(dá)有關(guān)[14-15]。金雀異黃素抑制腫瘤的機(jī)制目前還在進(jìn)一步的研究中。

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Evaluating the effect of paclitaxel and genistein on lung cancer A549 cell

SUN Ping，HOU Dong-binΔ

(Hospital of Central China Agricultural University,Wuhan 430070,China)

ObjectiveTo evaluate the effect of paclitaxel and genistein on the treatment of lung cancer.MethodsA549 cells were divided into saline group, PTX group, Gen group and (PTX+Gen) group. The anti-proliferation efficiency of paclitaxel combined with genistein was evaluated by MTT assay and flow cytometry test. A 549 cells were injected into mice by hypodermic in order to establish the animal model, which were used to evaluate the effect of anti-tumor.ResultsThe cell viability of A 549 cells were(57.0±4.5)%,(34.0±4.6)% and (77.0±4.4)% after the treatment of paclitaxel, genistein and paclitaxel+ genistein, respectively(P＜0.01). The effect of saline induced cells apoptotic was 7.6%,while paclitaxel,genistein and paclitaxel + genistein were 63.4%、41.2% and 84.5%, respectively(P＜0.01).The tumor inhibitory rates were(18.2±3.4)%, (32.1±4.2)%and(63.4±5.1)% in vivo for genistein, paclitaxel and paclitaxel+ genistein(P＜0.01).ConclusionBoth paclitaxel and genistein can inhibit the growth of lung cancer cell lines, and the combination of paclitaxel and genistein may be a potentially effective treatment for lung cancer.

paclitaxel; genistein; lung cancer; combination

R 734．2

A

1005-1678(2014)02-0001-03

肺癌作為嚴(yán)重威脅人類健康的頭號惡性腫瘤，國內(nèi)每年新發(fā)肺癌患者約50萬，到2025年預(yù)計(jì)我國每年將新發(fā)100萬肺癌患者[1]。肺癌的治療以手術(shù)為主，聯(lián)合化療為輔。擺在臨床醫(yī)師特別是腫瘤治療醫(yī)師面前的任務(wù)是極其繁重和艱巨的。當(dāng)前肺癌治療效果不理想，其主要原因是早期診斷率不高，大多數(shù)患者被確診為肺癌時已是中晚期或出現(xiàn)了遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。紫杉醇是來源于紅豆杉屬太平紫杉的一種細(xì)胞毒性物質(zhì)，被廣泛用于乳腺癌[2]、卵巢癌[3]、肝癌[4]和非小細(xì)胞肺癌的治療[5]。然而，以細(xì)胞毒為主的化學(xué)治療缺乏選擇性，難免產(chǎn)生許多不良反應(yīng)和毒性，病人耐受性較差。肺癌的治療迫切需要新的手段。紫杉醇能夠通過干擾細(xì)胞有絲分裂和分裂間期細(xì)胞功能所必需的微管網(wǎng)絡(luò)而起抗腫瘤作用。紫杉醇可與游離的微管蛋白結(jié)合，促進(jìn)微管蛋白裝配成穩(wěn)定的微管，同時抑制其解聚，導(dǎo)致喪失了正常功能的微管束的產(chǎn)生和微管的固定，從而抑制細(xì)胞的有絲分裂[6]。金雀異黃素是異黃酮類化合物的主要成分之一，廣泛分布在大豆、黃芪、葛根等植物中，具有多種生理及藥理活性。研究表明，金雀異黃素可抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長且具有抗癌增敏作用[7-9]，被認(rèn)為是一種很有潛力的腫瘤抑制劑。金雀異黃素能在體內(nèi)外抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡，還可阻斷腫瘤細(xì)胞β-catenin信號途徑，下調(diào)β-catenin核表達(dá)，上調(diào)其胞膜表達(dá)。本研究擬探討金雀異黃素聯(lián)合紫杉醇對肺癌A549細(xì)胞增殖的影響以及對荷瘤小鼠腫瘤的治療效果，為臨床治療提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

國家自然科學(xué)基金（81171365）

孫平，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：肺癌的基礎(chǔ)與臨床治療研究，E-mail：2094252562@qq.com；侯東彬，通信作者，女，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：肺癌的基礎(chǔ)與臨床治療研究，E-mail:315652027@qq.com。