劉智強，陳旭東，龍方懿，?；埒P△

（1.西南大學(xué) 藥學(xué)院，重慶 400715；2.萬州區(qū)龍駒鎮(zhèn)中心衛(wèi)生院，重慶 404000；3.四川大學(xué) 華西藥學(xué)院, 四川 成都 610041）

黏膜特異性多肽修飾載胰島素口服納米粒的制備及其體內(nèi)外評價

劉智強1，陳旭東2，龍方懿3，祝慧鳳1△

（1.西南大學(xué) 藥學(xué)院，重慶 400715；2.萬州區(qū)龍駒鎮(zhèn)中心衛(wèi)生院，重慶 404000；3.四川大學(xué) 華西藥學(xué)院, 四川 成都 610041）

目的構(gòu)建黏膜細(xì)胞特異性多肽（CSK）修飾的載胰島素（insulin，INS）口服納米粒（CSK-INS-NPs），并對其體外性質(zhì)以及體內(nèi)降血糖效果進行評價。方法用復(fù)乳法制備CSK修飾的載胰島素聚乳酸羥基乙酸（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）納米粒，對其理化性質(zhì)和包封率進行考察。通過體外人克隆結(jié)腸腺癌細(xì)胞（Caco-2）攝取實驗考察CSK修飾的納米粒的細(xì)胞穿透能力和跨膜能力。構(gòu)建糖尿病模型大鼠評價口服納米粒的降血糖能力。結(jié)果制備得到的CSK-INS-NPs粒徑為（134.4±15）nm，粒徑多分散系數(shù)小于0.3，胰島素的包封率（EE%）為71%。體外Caco-2細(xì)胞攝取實驗表明，細(xì)胞對CSK-INS-NPs攝取量是INS-NPs的2.8倍。相比于INS-NPs，CSK-INS-NPs能夠更加高效的穿透Caco-2細(xì)胞層。糖尿病大鼠的降糖實驗表明，在10 h內(nèi)，口服CSK-INS-NPs能夠降低血糖濃度，且保持穩(wěn)定。結(jié)論CSK能夠促進載胰島素納米?？缭紺aco-2細(xì)胞膜，CSK-INS-NPs是一種潛在的高效口服胰島素載體給藥系統(tǒng)。

胰島素；納米粒；降糖作用；多肽

糖尿病是一種與胰腺胰島相關(guān)的免疫性疾病，體現(xiàn)為胰島p細(xì)胞分泌功能發(fā)生障礙而導(dǎo)致胰島素分泌缺乏，使血液中葡萄糖不能被肝臟、肌肉等組織轉(zhuǎn)化為糖原。權(quán)威雜志Diabetes Care報道[1]：2000年全球糖尿病患者約為1.71億人，患病率為2.8%；估計到2030年，將增至3.66億人，患病率達(dá)到4.4%。美國糖尿病協(xié)會2005年統(tǒng)計，美國糖尿病患者已超過200萬，約占美國總?cè)丝诘?.0%[2]。而我國目前糖尿病患者約4000萬，患病率已高達(dá)3.2%，并且正以每年新增120萬患者的速度遞增[3-4]。

胰島素是脊椎動物胰臟p細(xì)胞分泌的多膚類激素，具降血糖作用，迄今為止仍為胰島素依賴型糖尿病患者的首選藥物，臨床主要以注射給藥為主?；颊唛L期注射胰島素會產(chǎn)生許多不良反應(yīng)，如胰島素浮腫、低血糖反應(yīng)、肥大性脂肪營養(yǎng)不良、皮下脂肪萎縮、注射部位炎癥，硬結(jié)等。因此開發(fā)非注射給藥的胰島素制劑成為了糖尿病治療研究的一個熱點。目前已有包括吸入劑、植入劑、透皮吸收制劑[5]等多種劑型的胰島素給藥方式，然而這些劑型的銷售和治療效果都不理想。有研究表明，胰島素經(jīng)口服途徑給藥最接近正常生理狀態(tài)下的胰島素分泌模式，但胰島素為親水性物質(zhì)，透過生物膜能力差，三維空間結(jié)構(gòu)脆弱，對環(huán)境敏感，在胃腸道中易被降解，口服生物利用度極低，僅注射途徑的0.5%[6]。本文研究了一種新型的胰島素口服PLGA納米粒給藥系統(tǒng)，PLGA是FDA批準(zhǔn)可用于納米載藥系統(tǒng)的緩釋藥用材料，PLGA納米?？捎行ПＷo胰島素免受胃腸道酶降解，增加其黏膜吸收[7-8],同時，納米粒采用多肽CSK修飾后能夠高效的穿透Caco-2細(xì)胞結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)胰島素的口服靶向和控釋給藥。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠（許可證號：20136281703，武漢大學(xué)動物實驗中心），Caco-2細(xì)胞（購自ATCC），人重組胰島素凍干粉（徐州萬邦），DMEM高糖培養(yǎng)液（Gibco），胎牛血清（Gibco），Hank’s緩沖液（Gibco），胰酶（含EDTA，Gibco）。異硫氰酸熒光素（FITC，Sigma），鏈脲佐菌素（STZ，Sigma），聚乳酸羥基乙酸(PLGA，山東省醫(yī)療器械研究所)，其他試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：Caco-2細(xì)胞用DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含10%胎牛血清、100 U／mL的青霉素、100 mg／L的鏈霉素。細(xì)胞置于37℃，飽和濕度，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期用于實驗。

1.2.2 FITC標(biāo)記胰島素的制備：參照文獻(xiàn)方法[9]，取FITC溶解于丙酮，胰島素溶于pH 7.2的含EDTA磷酸緩沖液，將FITC溶液加入胰島素溶液中，避光下置磁力攪拌器攪拌12 h，得到產(chǎn)物。將產(chǎn)物過葡萄糖凝膠柱，得到純化后的FITC標(biāo)記胰島素。

1.2.3 CSK修飾載胰島素PLGA納米粒的制備：參照文獻(xiàn)方法[10]合成CSK-PEG 2000-PLGA。稱取適量 FITC-INS溶解于含0.5%PVA的水溶液中，PLGA和CSK-PEG 2000-PLGA溶解于乙酸乙酯中，然后將水相緩緩注入有機相中，同時磁力攪拌，加完后超聲得胰島素初乳溶液（w/o）。將制備的初乳與含有濃度 20%的poloxmaer 188的外水相混合，同法超聲，即得胰島素復(fù)乳（w/o/w)。室溫減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至乙酸乙酯揮發(fā)完全，可得乳光明顯的膠體分散系，即得 CSK-INS-NPs。

1.2.4 載胰島素納米粒粒徑、電位和包封率的測定：取CSK-INS-NPs 溶液適量用馬爾文激光粒度儀測定其粒徑、PDI 和電位。CSK-INS-NPs 超高速離心，取上清液用高效液相色譜法測定其胰島素的含量。采用C18色譜柱，以乙腈∶水（0.2 mol/L Na2SO4，磷酸調(diào)pH至2.3）=28∶72為流動相，納米粒胰島素包封率的計算公式為：包封率=（投藥量-上清液胰島素質(zhì)量）/投藥量×100%

1.2.5 Caco-2細(xì)胞對CSK-INS-NPs的攝取考察：培養(yǎng) Caco-2細(xì)胞接種于24孔板中，當(dāng)孔板中細(xì)胞完全貼壁且處于對數(shù)生長期時加入一定量載FITC標(biāo)記胰島素納米粒樣品和FITC標(biāo)記胰島素，混合均勻后于CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h和4 h后，棄去培養(yǎng)基，加入適量PBS清洗3次，加入1 mL 1% triton-100裂解細(xì)胞，4℃避光裂解0.5 h以上，待裂解完全后，取各組樣品各200μL在 Ex=498 nm、Em=520 nm 用熒光分光光度計測定的熒光強度。

為了定性考察Caco-2細(xì)胞的攝取情況，將給藥培養(yǎng)4 h 后的細(xì)胞加入適量PBS清洗3次，加4%多聚甲醛固定15 min，棄去多聚甲醛，用冰PBS保存。置激光共聚焦熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞攝取情況。

1.2.6 CSK-INS-NPs的跨膜轉(zhuǎn)運實驗：將Caco-2細(xì)胞以2×105cells/cm2接種于Transwell聚碳酸脂膜上，培養(yǎng)3周后，用WPI細(xì)胞跨膜電阻儀測定跨膜電阻值（TEER），當(dāng)TEER值大于400 Ω·cm2時，可用作跨膜轉(zhuǎn)運實驗。跨膜轉(zhuǎn)運實驗時，上腔A面加入納米粒溶液，對照組為胰島素溶液，下腔B面均為PBS緩沖液。定時取出下腔B面溶液，用熒光分光光度法測定其中FITC標(biāo)記胰島素含量。

1.2.7 糖尿病大鼠的降血糖研究：取雄性健康SD大鼠實驗前禁食24 h，SD雄性大鼠腹腔注射60 mg/kg鏈脲佐菌素，1周后用血糖儀測定大鼠血糖，血糖濃度大于14 mmol·L-1大鼠為高血糖模型大鼠。將建模成功的SD大鼠30只隨機分成5組，分別為口服生理鹽水組、口服胰島素溶液組（50 IU/kg）、口服INSNPs（50 IU/kg）、口服CSK-INS-NPs（50 IU/kg）和注射胰島素組（5 IU/kg）。在2 h、4 h、6 h、8 h和10 h用血糖儀檢測大鼠的血糖值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 全部數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行處理。正態(tài)計量數(shù)據(jù)“x±s”表示。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One－Way ANOVA）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CSK-INS-NPs的粒徑、PDI、電位和胰島素包封率制備的納米粒粒徑與電位結(jié)果如表1所示，不同納米粒的的粒徑均小于200 nm，PDI小于0.3，zeta電位為-14 mV左右，胰島素的包封率達(dá)到70%以上。

表1 不同載胰島素納米粒的粒徑、電位和包封率（n=3）Tab.1 The size, zeta potential and entrapment ef fi ciency of insulin(n=3)

2.2 CSK增強Caco-2細(xì)胞對納米粒的攝取 Caco-2細(xì)胞與CSK-INS-NPs共同孵育后的熒光定量結(jié)果見圖1，結(jié)果顯示Caco-2細(xì)胞對CSK-INS-NPs的攝取效率分別是INSNPs和胰島素水溶液的2.8倍和6.5倍。

圖1 Caco-2 細(xì)胞對不同胰島素的攝取情況Fig.1 The uptake of different insulin by Caco-2 cells

Caco-2細(xì)胞攝取的定性觀察結(jié)果見圖2，結(jié)果顯示，CSKINS-NPs組、INS-NPs組和胰島素水溶液組熒光依次減弱。

圖 2 共聚焦顯微鏡Caco-2細(xì)胞對標(biāo)記FITC胰島素的攝取Fig.2 The confocal laser scanning microscopy (CLSM) images show the internalization of fluorescent insulin in cells

2.3 CSK增強納米?？缒まD(zhuǎn)運能力 通過檢測下腔B面均為PBS緩沖液的熒光強度，可以觀察到胰島素的跨膜量隨著時間的增加而增大，跨膜能力CSK-INS-NPs組＞INS-NPs組＞胰島素水溶液組(見圖3)。

圖3 隨時間變化過膜胰島素的量Fig.3 The ratio of insulin across the Caco-2 cell monolayer

2.4 CSK-INS-NPs具有穩(wěn)定持續(xù)降血糖作用 糖尿病大鼠的降血糖實驗表明，與生理鹽水組相比，注射胰島素和口服胰島素均具有降血糖作用，在給藥后10 h內(nèi)，注射胰島素組大鼠血糖水平有一個明顯的下降再回升的過程，在2 h后血糖水平降到最低，在8 h后恢復(fù)到給藥前的水平，口服胰島素溶液組血糖水平略微下降迅速回到給藥前水平。而口服CSK-INS-NPs組在10 h內(nèi)血糖水平穩(wěn)定，10 h后血糖濃度為給藥前71%(見圖4)。

圖4 給藥后的大鼠血糖變化曲線Fig.4 The blood glucose level of initial

3 討論

納米粒是有可生物降解的聚合材料構(gòu)成的直徑在10～1000nm的粒子，納米粒作為藥物載體可以減緩或消除體液中酸、堿和酶對包封于載體內(nèi)藥物的作用，提高藥物的生物穩(wěn)定性，避免藥物在達(dá)到病灶部位前被破壞；聚合材料降解緩慢可以實現(xiàn)藥物緩釋[11]，延長藥物作用時間，減少給藥劑量和毒副作用；通過控制納米粒粒徑，可克服體內(nèi)物理屏障，使藥物靶向輸送至病灶器官或組織的毛細(xì)血管，并透過毛細(xì)血管上的孔隙進入血管內(nèi)或組織[12]。另外，對聚合材料進行表面修飾可以實現(xiàn)納米粒的主動靶向。CSK肽是一段序列為CSKSSDYQC的具有生物活性的多肽。CSK是通過噬菌體展示技術(shù)得到的與腸內(nèi)皮細(xì)胞具有高度親和性的多肽，它可以高效的與腸內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，穿過內(nèi)皮細(xì)胞層，進入毛細(xì)血管[10-16]。本研究將胰島素包載到納米粒中，并將CSK連接到納米粒表面，實現(xiàn)了胰島素口服緩釋給藥同時，利用CSK與腸內(nèi)皮細(xì)胞的高度親和性實現(xiàn)納米粒的高效吸收。

本研究采用化學(xué)方法把FITC標(biāo)記胰島素，通過FITC熒光定量考察Caco-2細(xì)胞對CSK-INS-NPs的攝取。細(xì)胞攝取實驗結(jié)果顯示，CSK-INS-NPs與Caco-2細(xì)胞能夠高效結(jié)合，介導(dǎo)入胞。在考察納米粒Caco-2細(xì)胞單層膜的跨膜轉(zhuǎn)運實驗過程中，各組跨膜電位均保持穩(wěn)定，沒有降低，這表明，各給藥組均是通過細(xì)胞內(nèi)吞途徑跨膜，而不是破壞細(xì)胞之間的間隙。降血糖實驗表明，CSK-INS-NPs在10 h后還能持續(xù)穩(wěn)定的發(fā)揮降血糖作用，使血糖濃度維持在給藥前75%左右，注射胰島素組血糖在2 h迅速降低，在8 h后恢復(fù)到給藥前水平。而口服胰島素溶液組血糖濃度只是略微下降后迅速回升。因此，CSK-INS-NPs是一種高效緩釋胰島素口服給藥系統(tǒng)。

綜上所述，本研究制備了腸內(nèi)皮細(xì)胞靶向性的多肽CSK修飾的PLGA納米粒，解決了胰島素口服給藥容易被胃蛋白酶破壞，不能跨越生物膜等問題。該納米粒與Caco-2細(xì)胞具有良好的親和性，能夠通過網(wǎng)格蛋白以及內(nèi)吞小穴介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用穿過腸內(nèi)皮細(xì)胞層。由于PLGA聚合材料能夠?qū)崿F(xiàn)藥物緩釋，能夠持續(xù)穩(wěn)定發(fā)揮降血糖作用。另外，相較于注射給藥，口服載胰島素納米粒還能夠減少給藥次數(shù)。因此，CSK修飾的載胰島素納米粒是一種潛在的高效的胰島素口服給藥系統(tǒng)。

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CSK-conjugated PLGA nanoparticles enhance oral delivery of insulin

LIU Zhi-qiang1,CHEN Xu-dong2, LONG Fang-yi3，ZHU Hui-feng1△
(1.College of Pharmaceutical science and Traditional Chinese Medicine, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Center Hospital of Longju, Wanzhou 404000, China；3. Department of Pharmacology and Biopharmaceutics, West China School of Pharmacy, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

ObjectiveTo investigate the effects of CSK-conjugated PLGA nanoparticles on oral delivery of insulin in vitro and in vivo.Method CSK-INS-NPs were prepared by double-emulsion. Nanoparticle size、zeta potential and entrapment efficiency were measured. The efficiency of cellular uptake on Caco-2 cells in vitro was evaluated. The hypoglycemic effects were evaluated by monitoring the glucose levels in diabetic rats。ResultsThe average sizes was（134. 4 ± 15）nm and their PDI values were less than 0.3.The insulin entrapment ef fi ciency was around 71%. The cellular uptake of CSK-INS-NPs by Caco-2 cells was 2.8 times higher than INS-NPs. The CSK-INS-NPs transferred more insulin across the Caco-2 cell monolayer than INS-NPs and insulin solution did. In vivo experiments，the CSK-INS-NPs could reduce the blood glucose level of diabetic rats after oral administration in 10 h.Conclusion Compared with insulin solution，CSK-INS-NPs enhanced the insulin through Caco-2 cell monolayer by transcellular pathway and may be a potential delivery system for Oral Delivery of Insulin.

insulin; nanoparticles; hypoglycemic effect; peptide

R 945

A

1005-1678(2014)01-0079-03

劉智強，碩士在讀，研究方向：胰島素口服給藥系統(tǒng)的研究，Email：527236911@qq.com；祝慧鳳，通信作者，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向:中藥藥理及新藥研發(fā)工作，E-mail: zhfbsci@126.com。