左麗君，吳寶杰，劉飛，吳燕雯，范立強

（生物反應器工程國家重點實驗室 華東理工大學，上海 200237）

人乳頭瘤病毒1 8型E 6的點突變體對宮頸癌H e l a細胞生長和凋亡的影響

左麗君，吳寶杰，劉飛，吳燕雯，范立強△

（生物反應器工程國家重點實驗室 華東理工大學，上海 200237）

目的構(gòu)建并鑒定pcDNA 3.1(+)/HPV 18 E6及其突變體pcDNA 3.1(+)/E6 F49R、pcDNA 3.1(+)/E6 F127R真核重組表達質(zhì)粒，并在轉(zhuǎn)染Hela細胞后，檢測其對宮頸癌Hela細胞生長增殖的影響。方法用RT-PCR法從HeLa細胞中擴增HPV 18 E6基因及其突變體HPV 18 E6 F49R、HPV 18 E6 F127R、HPV 18 E6 F49R-F127R基因片段，構(gòu)建重組表達載體pcDNA 3.1(+)/HPV 18 E 6、pcDNA 3.1(+)/E6 F49R、pcDNA 3.1(+)/E6 F127R，在HeLa細胞中進行轉(zhuǎn)染，48 h后進行MTT試驗，利用吖啶橙/溴乙錠(AO/EB)雙染法在熒光顯微鏡下進行細胞形態(tài)學的觀察。結(jié)果成功構(gòu)建了3種重組表達載體;重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染到Hela細胞中;pcDNA 3.1(+)/HPV 18 E6能促進細胞增殖;pcDNA 3.1(+)/E6 F 49 R和pcDNA 3.1(+)/E6 F127R在一定程度上可抑制表達有E6全長的HPV陽性細胞系Hela的增殖;熒光顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)染了突變體重組質(zhì)粒的細胞均呈現(xiàn)細胞核皺縮，表現(xiàn)為早起凋亡現(xiàn)象。結(jié)論HPV 18 E6及其突變體的真核表達為研究其表達作用機制及為研究預防和治療子宮癌奠定基礎。

人乳頭瘤病毒HPV;真核表達;Hela細胞

本文從HeLa細胞中克隆擴增出E6蛋白（HPV 18 E 6）編碼基因及其突變體HPV 18 E6 F49R、HPV 18 E6 F127R編碼基因，將其和真核載體pcDNA 3.1(+)連接，成功構(gòu)建pcDNA 3.1(+)/ E6、pcDNA 3.1(+)/E6 F49R、pcDNA 3.1(+)/E6 F127R真核重組表達質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染到HPV陽性細胞系HeLa中表達觀察，為進一步研究HPV 18 E6及其突變體E6 F49R和E6 F127R作用機制及子宮癌的預防和治療奠定基礎。

1 材料

人子宮頸癌細胞HeLa（本實驗室保存），大腸桿菌DH5 α，真核表達空載體pcDNA-3.1(+)質(zhì)粒（本實驗室保存）?？寺≥d體pMD 18-T（寶生物）。TRIzol試劑（美國MD公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司），pMD-18 T、Taq DNA 聚合酶（寶生物），瓊脂糖（Biowest公司），DEPC（Invitrogen公司），限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶（寶生物），2×TaqMasterMix、質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒、DNA產(chǎn)物純化試劑盒（TIANGEN，北京），抗生素（AMRESCO）。常規(guī)化學試劑（國藥集團上海化學試劑公司）。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（購自Invitrogen公司；胎牛血清（FBS）；RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco產(chǎn)品）。倒置顯微鏡（重慶光學儀器廠），CO2組織培養(yǎng)箱（Thermo公司）。

2 方法

2.1 HeLa基因組總RNA提取及其cDNA合成 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒產(chǎn)品說明書操作，利用Trizol法提取HeLa細胞總RNA，再反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

2.2 HPV 18 E6基因的擴增與真核載體構(gòu)建 以Hela細胞cDNA為模板，利用正向引物（5’-TATGGTACCATGGCGCG CTTTGAGGATC-3’，Kpn I）和反向引物（5’-GGCGAATTCTTATA CTTGTGTTTCTCTGC-3’，EcoRI）進行PCR擴增，條件如下：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃復性45 s，72℃延伸50 s，共25個循環(huán)后，72℃再延伸5 min；PCR產(chǎn)物膠回收后與pMD-18 T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，篩選陽性克隆質(zhì)粒pMD-E6。將該陽性質(zhì)粒pMD-E6質(zhì)粒、pcDNA 3.1真核載體分別經(jīng)Kpn I和EcoR I雙酶切，切膠回收目的片段，并將載體和目的片段連接，轉(zhuǎn)化至DH-5α感受態(tài)細胞，涂布平板過夜培養(yǎng)。挑選菌落，搖菌，提取質(zhì)粒，酶切鑒定，確認目的片段正確插入。然后大量搖菌，制備用于真核載體pcDNA 3.1(+)/E6轉(zhuǎn)染的無菌質(zhì)粒。

2.3 HPV 18 E6 F49R突變體基因的擴增與真核載體構(gòu)建取連接T載體的目的基因的陽性克隆質(zhì)粒 pMD-E6，利用正向引物（5’-TTTGAATTTGCACGTAAAGATTTATTTGTGG）和反向引物（5’-CCACAAATAAATCTTTACGTGCAAATTCAAA）進行重疊PCR擴增，第一輪PCR條件如下：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃復性45 s，72℃延伸50 s，共20個循環(huán)后，72℃再延伸5 min；PCR產(chǎn)物膠回收后，在pfu酶作用下，進行第二輪PCR擴增，條件如下：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃復性45 s，72℃延伸50 s，共8個循環(huán)后，72℃再延伸5 min，；接著利用正向引物（5’-TATGGTACCATGGCGCGCTTTGAG GATC-3’，KpnI）和反向引物（5’-GGCGAATTCTTATAC TTGTGTTTCTCTGC-3’，EcoRI）進行第三輪PCR擴增，條件如下：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃復性45 s，72℃延伸50 s，共25個循環(huán)后，72℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物膠回收后與pMD-18 T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，篩選陽性克隆質(zhì)粒pMD-E6 F49R。將該陽性質(zhì)粒pMD-E 6 F49R質(zhì)粒、PCDNA 3.1真核載體分別經(jīng)Kpn I和EcoR I雙酶切，切膠回收目的片段，并將載體和目的片段連接，轉(zhuǎn)化至DH-5 α感受態(tài)細胞，涂布平板過夜培養(yǎng)。挑選菌落，搖菌，提取質(zhì)粒，酶切鑒定，確認目的片段正確插入。然后大量搖菌，制備用于真核載體PCDNA 3.1-E6 F49R轉(zhuǎn)染的無菌質(zhì)粒。

2.4 HPV18 E6 F127R突變體基因的擴增與真核載體構(gòu)建 取連接T載體的目的基因的陽性克隆質(zhì)粒pMD-E6，利用正向引物（5’-GAAAAACGACGACGTCACAACATAGCT）和反向引物（5’-AGCTATGTTGTGACGTCGTCGTTTTTC）進行重疊PCR擴增，三輪PCR條件同上，PCR產(chǎn)物膠回收后與pMD-18 T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，篩選陽性克隆質(zhì)粒pMD-E6 F127R。將該陽性質(zhì)粒pMD-E6 F127R質(zhì)粒、pCDNA 3.1真核載體分別經(jīng)KpnI和EcoRI雙酶切，切膠回收目的片段，并將載體和目的片段連接，轉(zhuǎn)化至DH-5α感受態(tài)細胞，涂布平板過夜培養(yǎng)。挑選菌落，搖菌，提取質(zhì)粒，酶切鑒定，確認目的片段正確插入。然后大量搖菌，制備用于真核載體pCDNA 3.1-E6 F127R轉(zhuǎn)染的無菌質(zhì)粒。

2.5 細胞的復蘇培養(yǎng) 用常規(guī)復蘇方法復蘇細胞，10%胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。轉(zhuǎn)染前，將含（1.5～5）×104個細胞種植到96孔板中，不加抗生素，轉(zhuǎn)染時保證細胞覆蓋率達90%～95%。

2.6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞 參照Invitogen公司梭華轉(zhuǎn)染試劑說明進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染實驗分為4組，分別為陰性對照組（轉(zhuǎn)染空載真核質(zhì)粒pcDNA 3.1(+)），實驗組pcDNA 3.1(+)/HPV 18 E6轉(zhuǎn)染組、pcDNA 3.1(+)/E6 F49R轉(zhuǎn)染組、pcDNA 3.1(+)/ E6 F127R轉(zhuǎn)染組，每組設5個復孔；每孔加人15μL轉(zhuǎn)染復合物（0.15μg質(zhì)粒溶于轉(zhuǎn)染試劑中），將96孔板放于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育，轉(zhuǎn)染48 h后進行檢測分析。

2.7 MTT法觀察重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對腫瘤細胞活力的影響配置MTT溶液過濾除菌后4℃保存。轉(zhuǎn)染及測定均于96孔培養(yǎng)板中進行，轉(zhuǎn)染48 h后，每孔加入20μL MTT母液，置于37℃CO2組織培養(yǎng)箱孵育4 h后，棄去孔板上清，加入150μL DMSO溶解，搖晃10 min后，待其充分混勻，酶標儀檢測490 nm處的吸光度值。本實驗抑制率=1-轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒實驗組/轉(zhuǎn)染空載對照組OD，OD值以“x±s”表示，采用統(tǒng)計學方法卡方檢驗分析。

2.8 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細胞中HPV 18 E 6 mRNA水平 采用Trizol法提取HeLa細胞總RNA。孔板培養(yǎng)細胞貼壁率約為80%～90%左右時，加入1 mL冰冷的Trizol，于室溫放置5 min，加人0.2 mL氯仿，用槍頭吹打混勻，冰浴中放置2 min，于4度以12000 r／min離心15 min；小心地將上層水相轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，加入等體積的異丙醇，混和后在冰浴中放置10 min；于4℃以12000 r／min離心10 min，小心地盡可能去除全部上清液；用1 mL 75%的乙醇洗滌沉淀和管壁，7500 r／min離心5 min，去除乙醇后將RNA室溫放置干燥5～10 min，用RNA-free DEPC水將所提取的RNA溶解。提取的RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，反轉(zhuǎn)錄mRNA合成cDNA。

2.9 AO/EB熒光染色法測定重組質(zhì)粒誘導細胞的凋亡 取處于指數(shù)生長期的HeLa細胞，加入適量0.25%胰酶消化，用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液配成懸液，用血球細胞板計數(shù)，配成2×105/mL，取放有蓋玻片的6孔細胞培養(yǎng)板，每孔加細胞懸液2 mL，將細胞板放在37℃，含5%CO2的培養(yǎng)箱中分別孵育18 h后取出。將各種重組質(zhì)粒分別加入各孔中，再將細胞板放在37℃，含5%CO2的培養(yǎng)箱中分別孵育48 h后取出細胞培養(yǎng)板。取出載玻片，加1滴混合熒光色液：100μg/mL吖啶橙(AO)和100μg/ mL嗅乙啶(EB)混勻，壓上爬滿細胞的蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞形態(tài)。

2.10 生長曲線繪制 將pcDNA 3.1(+)/HPV 18 E 6、pcDNA 3.1(+)/E6 F 49 R、pcDNA 3.1(+)/E6 F 127 R重組質(zhì)粒的陽性克隆細胞、pcDNA 3.1(+)空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HeLa細胞及未轉(zhuǎn)染的HeLa細胞調(diào)整細胞數(shù)為2×105個細胞數(shù)接種于24孔板內(nèi)，補足培養(yǎng)基1 mL/孔，37度，5% CO2孵箱中培養(yǎng)。每隔24 h消化細胞計數(shù)，每次每種細胞計數(shù)3孔，取3孔細胞的平均數(shù)，共檢測6 d，以細胞數(shù)為縱坐標，培養(yǎng)間隔時間為橫坐標，繪制生長曲線。

2.11 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 19.0軟件，正態(tài)計量資料以“x±s”表示，組間比較采用t檢驗，對于由不同觀察時間點構(gòu)成的多組數(shù)據(jù)，采用兩因素方差分析，定義P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 HPV 18 E6編碼基因的擴增 本研究采用試劑盒法提取HeLa細胞總DNA，并以其為模板進行PCR擴增，得到1條約477 bp的清晰條帶（見圖1）。將純化的PCR產(chǎn)物連接到pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH-5α感受態(tài)細胞中，隨機挑取5個單克隆鑒定菌液PCR。經(jīng)PCR擴增后在近500 bp處出現(xiàn)與目標基因大?。?77 bp）相符的條帶，可能為陽性克??；酶切鑒定和測序結(jié)果表明所擴增的產(chǎn)物符合要求（見圖2）。

圖1 HPV 18 E6基因PCRMaker.DNA maker IV；1.HPV 18 E6基因PCR結(jié)果Fig.1 PCR of HPV 18 E6Maker.DNA maker IV；1.PCR of HPV 18 E6

圖3 PMD-18 T-E6-F49R、PMD-18 T-E6-F127R雙酶切鑒定結(jié)果Maker.DNA Maker IV；1.PMD-18 T-E6-F49R雙酶切鑒定結(jié)果；2.PMD-18 T-E6 F127R雙酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Double digestion of PMD-18 T-E6-F49R and PMD-18 T-E6-F127RMaker.DNA Maker IV；1.Double digestion of PMD-18 T-E6-F49R；2.Double digestion of PMD-18 T-E6-F127R

圖2 PMD-18 T-E6質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果Maker.DNA Maker IV；1.PMD-18 T-E6重組質(zhì)粒；2.PMD-18 T-E6重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果Fig.2 Double digestion of PMD-18 T-E6Maker.DNA Maker IV；1.PMD-18 T-E6；2.Double digestion of PMD-18 T-E6

3.2 HPV 18 E6 F49R、HPV 18 E6 F127R突變體編碼基因的擴增 采用重疊PCR方法，以陽性pMD-E6質(zhì)粒為模板，進行三輪PCR擴增后，得到約477 bp的清晰條帶。將純化的PCR產(chǎn)物連接到pMD-18 T載體，轉(zhuǎn)化至DH-5 α中，酶切鑒定和測序結(jié)果表明所克隆的產(chǎn)物符合要求（見圖3）。

3.3 重組質(zhì)粒pcDNA 3.1-E6、pcDNA 3.1-E6F49R、pcDNA 3.1-E6F127R的構(gòu)建 載體pcDNA 3.1和克隆質(zhì)粒pMD-E 6、pMD-E6F49R、pMD-E6F127R分別用Kpn I和EcoR I雙酶切后連接、轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，對重組質(zhì)粒菌液PCR及酶切鑒定。結(jié)果顯示：PCR擴增得到目標條帶，雙酶切的兩條帶分別與載體和目的片段大小相符，測序結(jié)果也表明成功地構(gòu)建了pcDNA3.1-E6、pcDNA3.1-E6F49R、pcDNA3.1-E6F127R重組質(zhì)粒。

3.4 pcDNA 3.1-E6、pcDNA 3.1-E6 F49R、pcDNA 3.1-E6 F127R重組質(zhì)粒在HeLa細胞中的表達及MTT實驗 利用梭華轉(zhuǎn)染試劑，將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到HeLa細胞系，培養(yǎng)48 h后，進行MTT試驗。由表1可知：pcDNA 3.1-E6重組質(zhì)粒對HeLa細胞有一定的生長促進作用，pcDNA 3.1-E6 F49R、pcDNA 3.1-E6 F127R重組質(zhì)粒對HeLa細胞生長均有一定程度的抑制作用。pcDNA 3.1-E6 F49R重組質(zhì)粒基本上可以達到對于EC 109細胞半數(shù)抑制程度（見表1）。由表1可知，不同重組質(zhì)粒在48 h對HeLa細胞抑制作用不同。E6對HeLa細胞基本沒有抑制作用，反而一定程度上促進細胞的生長，HPV 18 E6 F49R和HPV 18 E6 F127R對HeLa細胞有一定的生長抑制作用，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 重組質(zhì)粒對HeLa細胞生長的抑制作用（n=4）Tab.1 The effects on proliferation of cervical carcinoma cell line Hela transfected with the recombinant plasmids(n=4)

3.5 重組質(zhì)粒在HeLa細胞內(nèi)的表達 RT-PCR瓊脂糖電泳結(jié)果見圖組中均在300 bp左右有一條條帶，與內(nèi)參β-actin大小一致，陰性對照組：pcDNA 3.1(+)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞在約500 bp處有很淡的條帶，那是因為HeLa細胞內(nèi)源性E6有表達。而實驗組：pcDNA 3.1(+)/HPV 18 E6、pcDNA 3.1(+)/ E6 F49R、pcDNA 3.1(+)/E6 F127R轉(zhuǎn)染組在約500 bp處有一明顯較亮條帶，大小與之相符合（見圖4）。實驗組相對于陰性對照組條帶明顯要量很多，表達量明顯變高，可見陰性對照組只表達內(nèi)源性E6蛋白，而轉(zhuǎn)染組里面成功轉(zhuǎn)染了對應質(zhì)粒，使細胞不僅表達內(nèi)源性E6蛋白，同時表達外源性E6蛋白，E6蛋白表達量明顯升高。

圖4 RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳M.1 Kb DNA ladder；1.pcDNA 3.1(+)/HPV 18 E6轉(zhuǎn)染組；2.pcDNA 3.1(+)/ E6 F49R轉(zhuǎn)染組；3.pcDNA 3.1(+)/E6 F127R轉(zhuǎn)染組；4.pcDNA 3.1(+)空載轉(zhuǎn)染陰性對照組Fig.4 RT-PCR products of E6 by agarose gel electrophores1.RT-PCR of E6 in HeLa which was transfected with pcDNA 3.1(+)/ HPV 18 E6；2.transfected with pcDNA 3.1(+)/E6 F49R；3.transfected with pcDNA 3.1(+)/E6 F127R；4.negative control：transfected with pcDNA 3.1(+)

3.6 AO/EB雙染熒光顯微鏡下觀察結(jié)果 熒光顯微鏡下觀察陰性對照組無明顯凋亡細胞。陰性對照組：轉(zhuǎn)染了pcDNA 3.1(+)空載質(zhì)粒的細胞，細胞呈正常的多邊形，細胞膜完整，整個細胞顯現(xiàn)綠色（見圖5 a）。pcDNA 3.1(+)/ HPV 18 E6轉(zhuǎn)染組沒有抑制HeLa細胞的生長，細胞呈現(xiàn)綠色（見圖5 b）。pcDNA 3.1(+)/E6 F49R轉(zhuǎn)染組了顯示了早期凋亡細胞的現(xiàn)象，細胞核出現(xiàn)固縮，細胞形狀不規(guī)則（見圖5 c）。pcDNA 3.1(+)/E6 F127R轉(zhuǎn)染組表現(xiàn)為細胞核為AO染色呈黃綠色熒光，濃聚成顆粒狀，位于細胞的一側(cè)，表現(xiàn)出早期凋亡現(xiàn)象（見圖5 d）。

圖5 細胞AO/EB雙染熒光圖Fig.5 Cell slide stained with AO and EB

3.7 轉(zhuǎn)染細胞生長曲線的繪制 分別對成功轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的陽性克隆細胞、陰性對照和空白對照組細胞繪制生長曲線(見圖6)。用方差分析比較每組細胞每天的細胞計數(shù)均值，結(jié)果表明：轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1(+)/HPV 18 E6基因的HeLa細胞的生長速度比pcDNA 3.1(+)/HeLa陰性對照組明顯加快，而轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1(+)/E6 F49R、pcDNA 3.1(+)/E6 F127R質(zhì)粒的HeLa細胞較陰性對照組有一定程度的抑制作用，且在第四、五、六天呈現(xiàn)顯著性差異(P＜0.01)。

圖6 轉(zhuǎn)染細胞生長曲線圖Fig.6 Growth curves of transfection cell

4 討論

人類乳頭瘤病毒(HPV)是一種具有種屬特異性的嗜上皮病毒，屬雙鏈閉環(huán)的小DNA病毒，包含約8000個堿基，其中包括8個早期開放讀碼框架（E1-E8）、2個晚期讀碼框架和1個非編碼長控區(qū)[7]。根據(jù)HPV的基因和致癌潛力加以劃分，目前已知的HPV類型有100多種，其中HPV 16和HPV 18是高致癌性，與宮頸癌息息相關(guān)[8]。在HPV早期開放讀碼框架中，E6和E7基因?qū)毎L刺激最為重要，其編碼的E6、E7蛋白與宿主細胞內(nèi)廣泛存在的PDZ結(jié)構(gòu)域相互作用，營造一種適合其轉(zhuǎn)化、增殖的體內(nèi)環(huán)境，可引起宮頸上皮細胞永生化，從而引起一系列的疾病，甚至誘導腫瘤的發(fā)生。而E6蛋白是參與細胞惡性轉(zhuǎn)化的主要蛋白[9-10]。

HPV E6蛋白大約由160個氨基酸組成，含有兩處Cys-X-X-Cys的鋅指結(jié)構(gòu)序列，即鋅指結(jié)構(gòu)一區(qū)和鋅指結(jié)構(gòu)二區(qū)，它在E6蛋白結(jié)合宿主細胞和鋅的轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要的作用[11]。正常體內(nèi)，E6-AP作為一種泛素連接酶，不與p53蛋白結(jié)合，若機體感染了高危型HPV，E6蛋白可同時與E 6-AP、p53蛋白通過鋅指結(jié)構(gòu)及PDZ結(jié)構(gòu)域相互作用，結(jié)合成三聚體復合物，導致p53受26 S泛素化蛋白酶體作用而被降解[12]。同時高危型HPV E6蛋白通過E 6-AP搭橋作用，促進其他相關(guān)抑癌蛋白p73、HDLG、MAG1-1、MUPP-1蛋白的降解[13]。而p53作為一種極其重要的抑癌蛋白，在腫瘤的抑制作用上發(fā)揮著重要作用。當p53等一系列抑癌蛋白被降解后，高危型HPV E6可破壞細胞骨架和細胞間緊密連接，致使細胞極性丟失，產(chǎn)生腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移的表型[14]。

根據(jù)文獻報道[5]的研究，將HPV 16第47位氨基酸由精氨酸（F）突變?yōu)楸奖彼幔≧），可以在一定程度上有效的抑制HPV陽性人子宮頸癌Hela細胞的增殖，表明該突變體HPV 16 E6 F47R將具有橋梁作用的鋅指結(jié)構(gòu)一區(qū)突變，可能在一定程度上抑制了E6、E6-AP和p53的相互作用結(jié)合，從而抑制內(nèi)源性E6的p53降解活性，激活依賴p53的生長停滯和凋亡功能，選擇性地誘導HPV陽性細胞系的生長抑制現(xiàn)象，從而誘導癌細胞衰亡。

目前研究的比較多且透徹的類型是HPV 16，而對于同樣高致癌性的HPV 18報道甚少。鑒于HPV 18和16型有著很大的相似性和同源性，實驗創(chuàng)新性地考慮同樣在HPV 18 E6鋅指結(jié)構(gòu)一區(qū)和鋅指結(jié)構(gòu)二區(qū)內(nèi)構(gòu)建點突變體（HPV 18 E6 F49R和HPV 18 E6 F127R），檢測其對宮頸癌HeLa細胞生長增殖的抑制作用情況，是一種新的探索宮頸癌的防治方式，具有創(chuàng)新性和可實施性。試驗將構(gòu)建成功的突變重組質(zhì)粒pcDNA 3.1(+)-E6 F49R、pcDNA 3.1(+)-E6 F127R成功轉(zhuǎn)染到HeLa細胞中，通過最初的MTT試驗，發(fā)現(xiàn)成功轉(zhuǎn)染48 h后，與轉(zhuǎn)染空載的對照組比較，突變組細胞抑制率約為25%左右，而野生型pcDNA 3.1(+)-E6轉(zhuǎn)染組幾乎沒有抑制效果。對檢測成功表達轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞的熒光染色發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染了兩種突變質(zhì)粒的細胞均出現(xiàn)細胞核皺縮、細胞變圓的早期凋亡特征；而轉(zhuǎn)染野生型E6的細胞相對于空載轉(zhuǎn)染組，細胞生長沒有受到抑制；結(jié)果可視化地表明成功轉(zhuǎn)染的突變體對HeLa細胞有一定的抑制作用，而野生型E6沒有明顯作用。為了更加明確的判斷轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對細胞的長期作用情況，實驗設計在6天內(nèi)檢測轉(zhuǎn)染細胞的生長數(shù)目，并繪制生長曲線，結(jié)果表明在培養(yǎng)的第3天后，突變體轉(zhuǎn)染組相比較空載轉(zhuǎn)染組和空白轉(zhuǎn)染組，細胞增殖速率呈明顯的下降趨勢(P＜0.01)。空白對照組和空載對照組沒有明顯區(qū)別，說明轉(zhuǎn)染空載體的細胞生長并沒有受到明顯影響。野生型E6轉(zhuǎn)染組在第4天開始呈一定的上升趨勢，可見野生型重組質(zhì)粒pcDNA 3.1(+) HPV 18 E6轉(zhuǎn)染進細胞后在一定程度上促進細胞的增殖。綜合以上實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：成功構(gòu)建并轉(zhuǎn)染進細胞的HPV 18 E6 F49R和HPV 18 E6 F127R突變質(zhì)粒能一定程度上抑制腫瘤細胞HeLa的增殖，可能與其鋅指結(jié)構(gòu)突變，導致E6和宿主PDZ結(jié)構(gòu)域作用減弱，抑制p53的降解，激活機體的免疫監(jiān)視作用息息相關(guān)。而野生型E6轉(zhuǎn)染組相反能緩慢促進細胞的增殖，可能與其E6蛋白通過其鋅指結(jié)構(gòu)發(fā)揮作用，促進E6-AP、p53、E6的相互綁定作用，從而進一步促進p53降解，導致細胞持續(xù)增殖有關(guān)。當然這種機制只是一種猜想，而其中涉及到的具體的分子機制還需要實驗進一步去探索和發(fā)現(xiàn)，這是實驗未涉及的不足之處。

本研究中將HPV 18 E6 F49R和HPV 18 E6 F127R突變體分別與真核載體pcDNA 3.1重組，構(gòu)建了pcDNA 3.1-E6 F49R、pcDNA 3.1-E6 F127R真核重組質(zhì)粒，并成功轉(zhuǎn)染到癌細胞中進行觀察，初步探索了HPV 18 E6的點突變體具有一定的抑癌作用，為宮頸癌的防治提供了一條全新的思路。然而要想將其開發(fā)成為一種新型的宮頸癌檢測、防治手段，還需要對其中所涉及到的可能的分子學機制和生物學功能進行進一步的探索和研究。

目前HPV檢測對于宮頸癌、宮頸癌前病變及癌癥治療后的篩查及監(jiān)測具有重要的意義。因此，對HPV的深入研究有利于我們更進一步的了解宮頸癌的生物學行為，為宮頸癌防治提供有效的策略[15]。本研究為進一步研究HPV 18 E6蛋白分子作用機及研究預防和治療子宮癌提供一定的基礎。

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Mutation of HPV 18 E6 inhibits the growth of Hela cells and induces apoptosis

ZUO Li-jun，WU Bao-jie，LIU Fei，WU Yan-wen，F(xiàn)AN Li-qiang△
(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China）

ObjectiveTo construct pcDNA 3.1(+)/HPV 18 E 6 fusion gene and a single-codon mutation pcDNA 3.1(+)/E6 F49R or pcDNA 3.1(+)/E6 F127R fusion gene in eukaryotic expression vector and study the effects on proliferation and apoptosis of cervical carcinoma cell line Hela。MethodHPV 18 E6 gene sequence and the single-point mutation HPV 18 E6 F49R or HPV 18 E6 F127R were ampli fi ed from total RNA of Hela cell line by reverse transcription- polymerase chain reaction ( RT- PCR), then the gene sequences were respectively inserted into pcDNA 3.1(+) vector to reconstruct recombinant plasmids which were transfected transiently into Hela cells. MTT and RT-PCR were used to test the expression levels of HPV 18 E6 and the growth of HeLa cells after transfected about 48 h. The proliferation and apoptosis of Hela cells were detected respectively by cell counting and AO/EB fl uorescent vital staining。ResultsThe pcDNA 3.1(+)/HPV 18 E6, pcDNA 3.1(+)/E6 F49R and pcDNA 3.1(+)/E6 F127R eukaryotic expression vectors were successfully constructed. The gene of HPV 18 E6 was discriminably detected in the HeLa cells which were transfected with the recombinant plasmids. After several days, the proliferation of Hela cells transfected with pcDNA 3.1(+)/ E6 F49R or pcDNA 3.1(+)/E6 F127R plasmid were obviously inhibited and the apoptotic rates were signi fi cantly increased, then the proliferation of cells transfected with pcDNA(+)/HPV 18 E6 was rather increased slightly, and we could observe the phenomena of early apoptosis and the formation of thekaryopyknosis by fl uorescent microscope in the cells transfected with pcDNA 3.1(+)/E6 F49R or pcDNA 3.1(+)/E6 F127R。ConclusionThe eukaryotic expressing vectors encoding HPV 18 E6 F49R and HPV 18 E6 F127R provide fundamental basis for the further study on HPV 18 E6 mechanism as well as prevention and treatment of uterine cancer.

human papillomavirus; eukaryotic expression; Hela cell

Q 78

A

1005-1678(2014)01-0051-05

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，嚴重威脅著女性的健康。人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是導致宮頸癌的罪魁禍首，它與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及惡性表型有密切聯(lián)系。研究證實，高危型HPV的感染，尤其是HPV 16、18型，90%以上與宮頸癌有關(guān)，而低危型HPV引起的尖銳濕疣、食道癌等仍是常見的疾病[1]。E6、E7蛋白是HPV的主要致癌轉(zhuǎn)化蛋白。E6蛋白可通過與p 53結(jié)合使其功能失活、激活端粒酶、破壞細胞黏附、極性和上皮分化等方式參與誘導細胞增殖、永生化和轉(zhuǎn)化等過程，逃避宿主免疫監(jiān)視[2]，也可結(jié)合在腫瘤壞死因子受體上，使細胞不受控制的增殖[3]。

體外表達的E6蛋白主要是兩個鋅指結(jié)構(gòu)，研究結(jié)果[4]顯示，鋅指一區(qū)和鋅指二區(qū)都是病毒轉(zhuǎn)化活性和引起蛋白反式激活所必須的，均與蛋間的相互作用有關(guān)。有文獻[5]報道，HPV-16 E6的點突變體——HPV 16 E6 F47R是p53聚泛素化降解的缺陷突變體，能感應早期的細胞衰老，選擇性地誘導HPV陽性HeLa細胞的生長抑制，可能是一種潛在的抗HPV感染的腫瘤藥物。另有文獻[6]報道，HPV 18 E6的兩個鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)域中，鋅指結(jié)構(gòu)二區(qū)的突變可能比鋅指結(jié)構(gòu)一區(qū)的突變，抑制腫瘤細胞無限增殖的效果更明顯。HPV 18型和16型有著很高的相似度，故實驗嘗試同樣在HPV 18 E6進行相應的點突變——HPV 18 E6 F49R和HPV 18 E6 F127R的這項研究，為宮頸癌抑癌方式的探究提供了一條新線索。

左麗君，女，碩士，E-mail：adtszlj 1115@126.com；范立強，通信作者，女，副教授，E-mail：fanglq@ecust.edu.cn。