胡志亮 沈 毅 田凱華△ 李 論 李 瑋

(1青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 青島 266003；2濟(jì)寧市第二人民醫(yī)院,山東 濟(jì)寧 272049)

肺癌是人類最常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率日益提高， 80%左右的肺癌患者不能得到早期診斷而失去手術(shù)治療的時(shí)機(jī)[1]。因此，肺癌的早期診斷和治療是困擾醫(yī)療人員的主要問題。肺癌的產(chǎn)生涉及多種因素[2]。肺癌抑癌基因甲基化的異常升高在肺癌的發(fā)病過程中起了重要作用，啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化作為p14ARF基因失活的重要形式可能參與了肺癌的發(fā)生[3]。我們檢測(cè)了非小細(xì)胞肺癌癌患者腫瘤和癌旁組織中p14ARF啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況，并對(duì)它們的臨床病理意義進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

107例肺癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織取自青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科新鮮手術(shù)標(biāo)本，均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)確診。男性81例，女性26例；年齡35～77歲，中位年齡為58.2歲。其中鱗癌43例，腺癌56例，其他8例；根據(jù)1997年UICC修訂的肺癌分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期37例，Ⅱ期31例，Ⅲ期29例；余參見表1。取其癌旁(距腫瘤邊緣>10cm)正常組織107例。所有標(biāo)本均無壞死組織，術(shù)前未進(jìn)行化療、放療。

表1 107例非小細(xì)胞肺癌患者p14ARF啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)分布(n，%)

1.2 方法

1.2.1DNA抽提 DNA抽提按照《分子克隆》常規(guī)進(jìn)行。

1.2.2p14ARF甲基化檢測(cè) 巢氏甲基化特異性PCR(NMSP)：1)基因組DNA的亞硫酸氫鹽修飾：目的使未甲基化的胞嘧啶經(jīng)脫氨基變?yōu)槟蜞奏ぁ?) PCR為基礎(chǔ)的甲基化分析：分別設(shè)計(jì)針對(duì)啟動(dòng)子區(qū)甲基化和非甲基化DNA的引物。

1.3 結(jié)果判定

檢測(cè)甲基化特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物存在為甲基化陽性；反之，不存在即為甲基化陰性，而且需非甲基化特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)存在才可判定甲基化陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)Pearson χ2檢驗(yàn)和Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1 p14ARF啟動(dòng)子通過巢氏甲基化技術(shù)的表達(dá)結(jié)果

p14ARF基因啟動(dòng)子的甲基化在原發(fā)性肺癌腫檢測(cè)瘤組織和癌旁組織分別是33.6%，12.1%。在腫瘤組織和癌旁組織中的p14ARF啟動(dòng)子的甲基化有顯著的差異(χ2= 12.811 ，P<0.001)。我們證明它們的Pearson相關(guān)性分析呈負(fù)相關(guān)， 見表2。

表2 兩組間甲基化分布及相關(guān)性比較(n，%)

2.2 臨床特征和p14ARF啟動(dòng)子甲基化之間的關(guān)系

p14ARF啟動(dòng)子甲基化陽性、陰性在性別、年齡、TNM分期和腫瘤大小方面無明顯差異。而在吸煙和不吸煙之間有顯著性差異。吸煙的明顯高于不吸煙的(χ2=4.378，P=0.023)。如表1。

54例腺癌中25例p14ARF啟動(dòng)子發(fā)生甲基化，43例鱗癌中甲基化有9例，腺癌的p14ARF啟動(dòng)子甲基化明顯高于鱗癌的(t=5.059，P=0.019)，如表3所示。

表3 不同組織類型組間p14ARF啟動(dòng)子發(fā)生甲基化的比較(n)

2.3 p14ARF啟動(dòng)子甲基化電泳結(jié)果

107例患者中，腫瘤組織發(fā)現(xiàn)36條甲基化帶，而在癌旁組織中只有13條甲基化帶，顯示p14ARF啟動(dòng)子甲基化在腫瘤組織中的甲基化頻率顯著高于相應(yīng)癌旁組織。在所有分組中，第13例患者最具有代表性，如圖1。

MA：DNA分子量標(biāo)記物 M:啟動(dòng)子p14ARF的甲基化 U：啟動(dòng)子p14ARF的非甲基化 TT：腫瘤組織；DC:癌旁組織

圖1 第13例患者p14ARF啟動(dòng)子甲基化特異性PCR電泳結(jié)果

該例肺癌病人中癌組織中存在明顯甲基化擴(kuò)增條帶(132bp)，而在癌旁組織中沒有甲基化條帶出現(xiàn)。

3 討論

隨著對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)基因突變并非腫瘤發(fā)生的唯一原因。甲基和一些核苷酸序列或組蛋白結(jié)合會(huì)改變“核酸-蛋白復(fù)合物”的形態(tài)，一些基因的表達(dá)發(fā)生改變。因此在未改變DNA的序列的情況下，這些變化仍然能夠影響細(xì)胞的功能，被稱為“表觀遺傳學(xué)”。表觀遺傳學(xué)在腫瘤發(fā)生中扮演重要角色，由此可以解釋當(dāng)人體遇到外界條件變化，諸如致癌物質(zhì)、環(huán)境變化、精神打擊等情況時(shí)，機(jī)體DNA序列并未發(fā)生實(shí)質(zhì)的改變，但表觀遺傳卻會(huì)發(fā)生了變化，導(dǎo)致細(xì)胞癌變。DNA甲基化被認(rèn)為是表觀遺傳學(xué)的主要機(jī)制之一，對(duì)其研究最早也最為清晰的表觀遺傳修飾方式[4]。抑癌基因以及相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化會(huì)導(dǎo)致基因的失活，從而引發(fā)組織癌變和促進(jìn)腫瘤形成[5]。p14ARF啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化同樣被認(rèn)為在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮了重要作用。

基因的突變、純合型缺失、雜合型缺失和啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化等是p14ARF基因的主要失活機(jī)制。p14ARF啟動(dòng)子區(qū)甲基化在多種人類腫瘤中均有報(bào)道。Esteller等在一組結(jié)直腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)p14ARF啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽性率為31%[6]。Weihnauch等檢測(cè)了19例原發(fā)性肝血管肉瘤中啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，報(bào)告甲基化陽性率是26%，曾經(jīng)指出CpG啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化是p14ARF基因失活的重要方式[7]。近來，Kim等針對(duì)p14ARF啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況是否吸煙的因素有關(guān)系做了檢測(cè)，其結(jié)果甲基化陽性率為9%[8]。

資料顯示I期肺癌患者的5年生存率約為60%，Ⅱ-Ⅳ期臨床肺癌的5年生存率從40%到5%之間[9]。這主要?dú)w咎于缺乏可靠有效的早期發(fā)現(xiàn)和診斷的手段。p14ARF基因啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要角色，是一個(gè)早期事件，同時(shí)被認(rèn)為是可以用MSP技術(shù)檢測(cè)到的潛在的早期診斷標(biāo)志物[10]，可以作為癌癥早期診斷的一種輔助方法，并對(duì)其預(yù)后具有一定預(yù)測(cè)價(jià)值[11]。通過Spearman相關(guān)分析，p14ARF啟動(dòng)子的甲基化情況在腫瘤組織中和相應(yīng)癌旁組織中相關(guān)性極差。如果我們還可以進(jìn)一步檢測(cè)在血液中p14ARF啟動(dòng)子的甲基化狀況與腫瘤的關(guān)系，這將對(duì)我們?cè)缙谠\斷肺癌提供一個(gè)血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

由于在標(biāo)本中DNA比較稀少，我們進(jìn)行了更敏感的改良巢甲基化特異性RCR檢測(cè)方法，為肺癌的早期診斷提供依據(jù)。我們的研究與以往報(bào)告的結(jié)果幾乎一致。我們發(fā)現(xiàn)p14ARF啟動(dòng)子的甲基化在吸煙和不吸煙患者之間有顯著差異(χ2=4.378，P=0.023)。目前的研究結(jié)果已經(jīng)證明，吸煙是肺癌的主要促發(fā)因素，如表1所示，在單因素分析中，我們也證明吸煙是一個(gè)重要的危險(xiǎn)因素。

我們的研究同樣顯示腺癌中的p14ARF啟動(dòng)子甲基化明顯高于鱗癌。腺癌比鱗癌在應(yīng)用靶向藥物治療方面更有價(jià)值、更加敏感及突出優(yōu)勢(shì)，臨床研究也顯示化療的敏感性鱗癌明顯優(yōu)于腺癌。表觀遺傳學(xué)改變可以干擾化療敏感性，p14ARF啟動(dòng)子的甲基化可能使肺癌腺癌的化療的敏感性下調(diào)。這提示改變p14ARF啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)可以提高化療的敏感性。

在本文中，TNM分期是最危險(xiǎn)的因素，p14ARF啟動(dòng)子甲基化危險(xiǎn)性排名僅次于吸煙，位于第三。在先前的研究中，還沒有直接的證據(jù)可以證明p14ARF啟動(dòng)子甲基化作為診斷依據(jù)，但目前的研究結(jié)果為今后的臨床和基礎(chǔ)研究提供了一種特殊的方法。并且我們今后的研究中正在考慮通過p14ARF啟動(dòng)子去甲基化來提高化療及放療的敏感性，去治療非小細(xì)胞肺癌病人。

在本文中存在以下幾個(gè)限制：首先，p14ARF啟動(dòng)子甲基化需要獲得組織標(biāo)本，然而對(duì)早期患者則非常困難；其次，作為前瞻性研究，對(duì)臨床特征評(píng)價(jià)不夠精確地；再次，收集的病例數(shù)偏少，分離組織中的DNA也是不完美，特別是存放已久的組織標(biāo)本。因此，我們的數(shù)據(jù)的確認(rèn)需要進(jìn)一步驗(yàn)證，通過的多中心、大樣本的測(cè)試方法。

通過檢測(cè)p14ARF基因啟動(dòng)子甲基化在非小細(xì)胞肺癌腫瘤及癌旁組織中的表達(dá)情況，研究p14ARF啟動(dòng)子區(qū)甲基化在肺癌發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制，我們認(rèn)為檢測(cè)p14ARF基因甲基化狀態(tài)可作為肺癌早期診斷或判斷預(yù)后的一個(gè)有價(jià)值的生物學(xué)標(biāo)志。在將來的研究中，我們有可能尋找合適的去甲基化試劑，恢復(fù)抑癌基因的活性，為抗腫瘤治療及基因干擾治療提供一種思路和理論基礎(chǔ)。

[1] Gatta G,Ciampichini R,Bisanti L,et al.Estimates of cancer burden in Lombardy[J].Tumori，2013,99(3):277-284.

[2] Wilson IM,Vucic EA,Enfield KS,et al.EYA4 is inactivated biallelically at a high frequency in sporadic lung cancer and is associated with familial lung cancer risk[J].Oncogene，2013,10(7):1038.

[3] Watanabe T,Nakamura M,Yonekawa Y,et al.Promoter hypermethylation and homozygous deletion of the p14APF and p16INK4a genes in oligo dendroghomas[J].Acta Neuropat hol，2001,101(3):185-189.

[4] Griffiths EA,Gore SD,Hooker CM,et al.Epigenetic differences in cytogenetically normal versus abnormal acute myeloid leukemia[J].Epigenetics，2010,5(7):590-600.

[5] Tam KW,Zhang W,Soh J,et al.CDKN2A/p16 Inactivation Mechanisms and Their Relationship to Smoke Exposure and Molecular Features in Non-Small-Cell Lung Cancer[J].Thorac Oncol，2013,8(11):1378-1388.

[6] Esteller M,Tortola S,Toyota M,et al.Hypermethylation-associated inactivation of p14(ARF)is independent of p16(INK4a)methylation and p53 mutational status[J].Cancer Res，2000,60(1):129-133.

[7] Watanabe T,Katayama Y,Yoshino A,et al.Aberrant hypermethylation of p14ARF and O6-methylguanine-DNA methyltransferase genes in astrocytoma progression[J].Brain Pathol，2007,17(1):5-10.

[8] Kim HJ,Kim MH,Song MH,Song DE,Yu E.Immunohistochemical study of p53 mutation and p16,p14 alterations encoded by INK4a-ARF in mucin-hypersecreting bile duct tumor[J].Korean J Gastroenterol，2005,45(3):189-194.

[9] Takayama K,Inoue K,Tokunaga S,et al.A Phase II study of concurrent thoracic radiotherapy in combination with weekly paclitaxel plus carboplatin in locally advanced non-small cell lung cancer:LOGIK0401[J].Cancer Chemother Pharmacol,2013,72(6):1353-1359.

[10] Sanchez-Cespedes M,Reed AL,Buta M,et al.Inactivation of the INK4A/ARF locus frequently coexists with TP53 mutations in non-small cell lung cancer[J].Oncogene，1999,18(43):5843-5849.

[11] Deng D,Liu Z,Du Y Epigenetic alterations as cancer diagnostic,prognostic,and predictive biomarkers[J].Adv Genet,2010,71:125-176.