甄恩明 姜剛勇 劉洪偉 楊兆安 馬建軍

(1 濟寧醫(yī)學院附屬濟寧市第一人民醫(yī)院，山東 濟寧 272011； 2 溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325000)

目前，利用組織工程原理構建人工涎腺組織為涎腺組織再生提供新的思路。生物材料的制備是組織工程一個重要組成部分，要求種子細胞能與制備的支架材料形成三維空間復合體，并且在該復合體中支架材料具有引導細胞生長的重要作用。目前還未找到一種理想的生物支架材料用于涎腺組織工程的研究。我們已對采取凍融聯(lián)合酶消化—冷凍干燥法制備的脫細胞腮腺基質進行組織學特征的觀察[1]。本文通過體外毒性試驗、全身急性毒性及亞毒性試驗、細胞相容性等評價脫細胞腮腺基質的生物相容性，證明采取凍融聯(lián)合酶消化—冷凍干燥法制備的脫細胞腮腺基質是良好的涎腺組織工程支架材料。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 健康成年新西蘭大白兔，雄性，體重2～3kg，提供單位(溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院龍灣實驗室)，將動物飼養(yǎng)于動物房，室溫(23±1)℃，濕度(50±10)%，噪音60Db,正常進飲食。

1.1.2主要試劑和儀器 磷酸鹽緩沖液(Gbico,美國)；脫氧膽酸鈉鹽(奧博星，中國)；DNaseⅠ(MBI，立陶宛)；RNaseA(MBI，立陶宛)；DMEM/F12(1∶1)(Gbico,美國)。722型分光光度計(天翔，中國)；掃描電鏡(HITACHI S-3000N，日本)。

1.2 實驗方法

1.2.1脫細胞腮腺基質材料制備 通過凍融聯(lián)合酶消化—冷凍干燥法制備脫細胞腮腺基質[1]：無菌條件下，取兔的新鮮腮腺，磷酸鹽緩沖液充分沖洗，三蒸水充分漂洗，放置于-80℃深低溫冰箱中冷凍1h，在室溫下解凍；將解凍的腮腺組織放置于蒸餾水內,在室溫下浸泡6h，2h換液1次；將組織置于3%的脫氧膽酸鈉鹽蒸餾水溶液中(加適量1mol/L NaOH調節(jié)溶液pH值至8～9)震蕩4h(恒溫回旋振蕩器內持續(xù)振蕩，25℃100r/min)；繼續(xù)蒸餾水中振蕩3h，每小時更換液體1次；放置于1ku/ml DNaseⅠ及RNaseA混合液中振蕩30min；然后放置于蒸餾水中浸泡3h，每小時換液1次；最后將處理后的腮腺組織放置在冷凍干燥機中冷凍干燥，60Co照射消毒，照射劑量215 Gy，消毒后放在-80℃冰箱保存。

1.2.2腮腺腺細胞分離和培養(yǎng) 腮腺細胞的體外分離、培養(yǎng)和生物學特征鑒定參見Fujita-Yoshigaki J 的文章[2]具體操作如下：無菌條件下取健康的新西蘭大白兔(體重2～3kg)腮腺組織。Hank's液清洗數(shù)次,去除包膜、脂肪、血管及結締組織。剪碎，膠原酶消化，過濾，離心，細胞懸浮于2ml完全培養(yǎng)液：DMEM/F12(1∶1)，含10%FBS，5g/ml胰島素和轉鐵蛋白，10ng/ml表皮生長因子，100ng/ml氫化可的松，1%抗生素，細胞懸液緩慢移至另一裝有10ml完全培養(yǎng)液的15ml離心管中液面上層。37℃放置10min，收集下層2ml細胞進行計數(shù)，以2×104/ml密度接種于24孔培養(yǎng)板，置于5%CO2、37℃，培養(yǎng)箱中進行原代培養(yǎng)。當原代細胞培養(yǎng)3d后進行第1次換液，原代細胞繼續(xù)培養(yǎng)至6d后見細胞大量生長鋪滿培養(yǎng)瓶底壁，胰蛋白酶消化后傳代培養(yǎng)。

1.2.3材料浸提液的制備 依據(jù)標準：ISO10993：12(GB/T16886.12)，將脫細胞腮腺基質材料與DMEM/F12培養(yǎng)液按照0.2g/ml比例將材料放入DMEM/F12培養(yǎng)液(含10%FBS)中，37℃下放置72h來制備浸提液用于細胞毒性試驗；按0.2g∶1ml的脫細胞腮腺基質材料與生理鹽水的比例進行萃取，條件為37℃，時間為72h用于動物體內試驗。萃取液應在2h內使用完畢。

1.2.4體外細胞毒性試驗 取同體積的浸提液與DMEM/F12培養(yǎng)液(含10%FBS)混合稀釋成濃度50%的浸提液。取第3代生長及細胞形態(tài)良好的腮腺細胞，以1×107/L密度接種于3塊96孔板上，5孔/組，100μl/孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，吸出原培養(yǎng)液。對照組(A組)加入新配制的DMEM/F12(10% FBS)100μl，實驗組分別在96孔板中加入濃度為50%(B組)和100%(C組)浸提液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在第3天、第5天、第7天取出96孔培養(yǎng)板，將5g/L的MTT 20μl/孔加到每個孔中繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后倒出培養(yǎng)液，將DMSO100μl/孔加到每個孔中震蕩10min，利用酶聯(lián)免疫檢測儀以490nm波長測A值。評估脫細胞基質材料的毒性通過計算相對增值率(relative growth rate，RGR)來評估：RGR=(實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.2.5急性毒性試驗 隨機選取健康的新西蘭大白兔10只，體重2～3kg，隨機分成2組，5只每組，飼養(yǎng)在相同環(huán)境和條件下。實驗組按照15ml/kg將脫細胞腮腺基質材料浸提液(按0.2g∶1ml生理鹽水的比例進行萃取，37℃ 72h制備浸提液)注入兔的腹腔，將等量生理鹽水注入對照組兔的腹腔，注射后24、48、72h分別觀察兔的神志、精神、呼吸等一般狀況及可能發(fā)生的不良反應。

1.2.6亞急性毒性試驗 隨機選取新西蘭大白兔10只，體重2～3kg，稱重，在相同環(huán)境和條件下飼養(yǎng)，并隨機分成2組，5只/組。實驗組將脫細胞腮腺基質材料浸提液(按0.2g∶1ml生理鹽水的比例進行萃取，37℃ 72h制備浸提液)注入兔的腹腔，每周5次，對照組將等量生理鹽水注入兔的腹腔，1個月后稱重后取心、肝、肺、腎組織做病理學檢查。

1.2.7溶血試驗 將2%草酸鉀添加到新鮮采集兔血液40ml中制成抗凝兔血，然后取新鮮抗凝兔血10ml與0.9%NaCl 10ml混合稀釋。脫細胞腮腺基質材料浸提液(按0.2g∶1ml生理鹽水的比例進行萃取，37℃ 72h制備浸提液)10ml/管的為實驗組，蒸餾水10ml/管作為陽性對照組及生理鹽水組10ml/管作為陰性對照組，放入37℃水浴溫箱1h后在上述3組中分別加入抗凝兔血0.2ml，每組10管，用722型分光光度計于545nm處檢測A值(取平均值)，計算溶血程度(用%表示)：溶血程度=(實驗組A值-陰性對照組A值)/(陽性對照組A值-陰性對照組A值)×100%?？谇簧锊牧蠈θ苎囼灥囊鬄槿苎潭?5%。

1.2.8熱原試驗 隨機選擇至少3周內未使用過脫細胞腮腺基質材料浸提液的新西蘭大白兔3只，體重2～3kg，在預測體溫前7日用同一飼料飼養(yǎng)，在此期間，體重不減輕，精神、食欲、排泄等無異?，F(xiàn)象，每隔30min測量體溫1次，共測量8次，每次體溫均在38.0～39.6℃的范圍內，且最高與最低體溫相差不超過0.4℃，供熱原檢查用。試驗用試管采用干熱滅菌法置烘箱中用250℃加熱30min去除熱原。取置于38℃恒溫水浴箱加熱1h的脫細胞腮腺基質生理鹽水浸提液(按0.2g∶1ml生理鹽水的比例進行萃取，37℃ 72h制備浸提液)緩慢注入處于安靜狀態(tài)下兔的耳緣靜脈，劑量為10ml/kg，30min測量兔體溫1次，共測量6次，取6次體溫中最高的一次減去正常體溫，為該兔體溫的升高溫度。以升高0.6℃以內且3只兔體溫升高總和小于1.4℃為正常(當家兔體溫升高為負值時，均以0℃計)。

1.2.9掃描電鏡觀察 取接種腮腺細胞與脫細胞腮腺基質材料復合培養(yǎng)7d后，固定于25g/L戊二醛溶液中，0.1mol/L磷酸緩沖液反復沖洗，然后用10g/L鋨酸固定，按照50%→70%→95%→無水乙醇→絕對乙醇的順序進行乙醇梯度脫水，液態(tài)CO2臨界點干燥，離子噴鍍機鍍膜，在掃描電鏡下觀察超微結構并照相。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用spss19.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結 果

2.1 體外細胞毒性試驗

體外細胞毒性試驗結果見表1。結果顯示3、5、7d的B、C組與A組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明脫細胞腮腺基質材料對兔腮腺細胞增值無明顯抑制。

表 1 體外細胞毒性試驗結果

2.2 急性毒性試驗

分別于24、48、72h觀察實驗組與對照組兔，可見所有兔子神志清，精神可，活動無異常，食欲正常，無呼吸加速及呼吸困難出現(xiàn)，大小便正常，未出現(xiàn)腹部刺激癥狀及死亡現(xiàn)象。

2.3 亞急性毒性試驗

實驗組兔喂養(yǎng)1個月，一般情況良好，精神狀態(tài)可，食欲正常，大小便正常，體重均有增加，心、肝、脾、肺、腎組織學檢查未見組織和細胞變性。

2.4 溶血試驗

實驗組與陰性對照組均無明顯溶血現(xiàn)象，陽性對照組可見全部溶血。用分光光度計檢測A值(取平均值)根據(jù)溶血程度公式計算出實驗組溶血程度為1.86%，符合口腔生物植入材料的溶血實驗要求。

2.5 熱原試驗

注射浸提液后每間隔30min測量1次兔的肛門溫度，兔的升高溫度的最高值均小于0.6℃，體溫升高總和小于1.4℃，符合致熱原試驗要求(見表2)。說明制備的脫細胞腮腺基質材料所含熱原均符合生物體的要求，具有良好的生物相容性。

2.6 掃描電鏡觀察

鏡下見材料呈現(xiàn)局部放大呈現(xiàn)毛氈樣外觀，有溝、嵴及三維網(wǎng)狀結構，膠原未見明顯斷裂的三維網(wǎng)狀結構；掃描電鏡觀察兔脫細胞腮腺基質材料表面培養(yǎng)的腮腺細胞呈類圓形或多角形，各個細胞的突觸的長短、粗細以及數(shù)目各不相同，部分細胞表面可見顆粒狀突起，偶見分泌顆粒(圖1)。

表2 浸提液注射引起的體溫變化(℃)

圖1 腮腺細胞接種到脫細胞腮腺基質材料7d后的掃描電鏡表現(xiàn)(×600)

3 討 論

口腔中的唾液來自涎腺，具有保護和潤滑、清潔口腔、抗菌等作用。各種原因導致唾液分泌量減少致使唾液的自我清潔能力和抗菌能力減弱，患者可能會出現(xiàn)齲齒、牙周炎、咀嚼吞咽困難、口咽部感染等疾病，嚴重影響患者的生活質量[3]。目前治療唾液減少可以用藥物刺激具有分泌功能的殘余腺體分泌唾液，或者利用人工唾液，前者使用的藥物有副作用，而人工唾液只是暫時的替代治療。組織工程利用種子細胞附著具有生物相容性的三維支架材料來構建具有功能的器官[4]。支架材料是組織工程研究的重要組成部分，生物支架材料作為種子細胞生長的支架，種子細胞黏附于其表面，并且生物支架材料自身對培養(yǎng)的種子細胞的活性及增殖能力有影響[5-6]。

脫細胞基質材料是一種通過人工的方法將其細胞以及可溶性蛋白質去除的天然生物支架材料，具有無抗原、生物相容性好、不易引起感染或排斥反應的優(yōu)點，并且能為種子細胞的生長營造接近體內的培養(yǎng)生長環(huán)境[7]。通過凍融聯(lián)合酶消化—冷凍干燥法制備的脫細胞腮腺基質在以往的研究中[1]表明細胞成分能有效去除，具有低免疫原性 保留了利于腮腺細胞生長的具有有序排列的基質膠原，有一定的強度和韌性。

本文通過脫細胞腮腺基質材料的體外細胞毒性試驗可見浸提液組與對照組之間A值無顯著差異性，表明通過凍融聯(lián)合酶消化法制備的脫細胞腮腺基質材料對體外培養(yǎng)的腮腺細胞的生長沒有毒性；全身急性毒性試驗顯示脫細胞腮腺基質材料對新西蘭大白兔機體無毒性及刺激作用；通過溶血實驗結果表明脫細胞腮腺基質材料具有良好的化學穩(wěn)定性，無釋放對紅細胞產生破壞溶解作用的有害物質，沒有引起急性溶血反應；熱原試驗表明制備的脫細胞腮腺基質材料所含熱原均符合生物體的要求，具有良好的生物相容性；通過掃描電鏡的觀察可見腮腺細胞附著于脫細胞腮腺基質材料的三維結構上，并有外分泌顆粒生成，證明復合于脫細胞腮腺基質材料上的腮腺細胞是有分泌功能存在的。

本文證明脫細胞腮腺基質材料可以提供為腮腺細胞附著的具有生物相容性的三維結構，對實驗動物無毒性刺激，具有良好的化學穩(wěn)定性，沒有釋放能引起急性溶血的有害物質，是一種良好的生物支架材料。脫細胞腮腺基質材料的三維網(wǎng)狀結構以及胞外基質的對復合在脫細胞處理的基質材料表面的腮腺細胞功能的發(fā)揮是否存在密切關系，仍需與其他高分子材料以及其他生物衍生材料相比較，并對是否具有形成外分泌腺分泌涎腺的流出管道的能力，需要進行進一步的研究才能得出結論。

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