潘興麗 關(guān) 晶

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)系，山東 日照 276826)

國內(nèi)外大量報道顯示[1]：腎癌的發(fā)病率占所有惡性腫瘤的2%～3%，其致死率已經(jīng)上升到所有致死性腫瘤的第7位，且發(fā)病率在世界范圍內(nèi)仍呈逐年上升趨勢。早在20世紀(jì)70年代，人類就開始了線粒體基因突變與腫瘤發(fā)生關(guān)系的研究。自Polyak K[2]于1998年首先發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌中線粒體DNA(mitochondrial,mtDNA)基因型存在突變以來，腫瘤的發(fā)生與mtDNA突變間的關(guān)系逐漸成為近年醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，到目前為止，在多種腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)了不同的mtDNA突變位點(diǎn)[3-5]。線粒體D-loop區(qū)又稱控制區(qū)(control region，CR)或非編碼區(qū)(non-coding region，NC)。D-loop區(qū)基因突變將直接導(dǎo)致線粒體功能紊亂，進(jìn)一步影響線粒體編碼區(qū)的功能[6]。本文通過對腎癌患者癌組織mtDNA的D-loop區(qū)基因突變進(jìn)行檢測和對照分析，可為腎癌發(fā)生的病因?qū)W研究提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為腎癌的臨床診斷和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

選取經(jīng)病理證實(shí)為腎癌患者20例，其中男性15例，女性5例，年齡28～78歲，平均年齡(52.21±19.87)歲。在簽訂知情同意書后，選取腎癌患者手術(shù)中切下的腫瘤組織及少量距腫瘤組織邊緣5 cm以外的正常組織作為研究材料，所有組織取下后即刻置入-80℃保存。

1.2 DNA抽提

DNA提取試劑盒(美國Promega公司)，提取腎癌組織及相應(yīng)外周正常組織的細(xì)胞總DNA。

1.3 PCR擴(kuò)增及序列測定

D-loop區(qū)的PCR擴(kuò)增引物采用primer 5.0軟件進(jìn)行設(shè)計，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，上游引物(nt15791-15810)為：5′-ATCATTGGACAAGTAG-CATC-3′，下游引物(nt725-706)為：5′-GGTGAACT-CACTGGAACGGG-3′。PCR的反應(yīng)體積為50μl，包括2種引物(20 pmol/μl)各1μl；10×PCR緩沖液5μl；dNTPs(2.5 mmol/L)4μl；Mg2+(25 mmol/L)3μl ；ExTaq DNA聚合酶(5 U/μl)0.5μl及細(xì)胞DNA100 ng。PCR擴(kuò)增： 變性(94℃，45 s)、復(fù)性(56℃，45s)、延伸(72℃，90s)、結(jié)束延伸(72℃，7min)，重復(fù)35個循環(huán)。取2μl反應(yīng)產(chǎn)物，在1.5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。對于擴(kuò)增效果良好且足量的樣品，進(jìn)一步進(jìn)行純化和測序(委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行)，測序反應(yīng)所用引物與PCR反應(yīng)引物相同，所有樣品均進(jìn)行雙向測序。

1.4 序列分析

擴(kuò)增后的測序結(jié)果采用DNAStar軟件的Meqalign5.00程序進(jìn)行分析，序列變化與標(biāo)準(zhǔn)劍橋mtDNA序列進(jìn)行比對[7]。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

用nt15791-15810/nt725-706引物擴(kuò)增各標(biāo)本mtDNA，所有樣品均擴(kuò)增出1450bp片段，擴(kuò)增片段大小與預(yù)期相一致，見圖1。

2.2 腎癌患者mtDNA D-loop區(qū)突變情況

在所有的20例腎癌患者中，有7位患者的腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了17個不同的突變，因此初步推斷腎癌細(xì)胞mtDNA D-loop區(qū)的突變率約為35%；17個突變中4個屬微衛(wèi)星不穩(wěn)定序列(表1)。

2.3 腎癌患者mtDNA D-loop區(qū)多態(tài)性變化情況

通過將腎癌患者mtDNA D-loop區(qū)所測位點(diǎn)與基因庫數(shù)據(jù)進(jìn)行對照，發(fā)現(xiàn)206個核苷酸變化，其中197個多態(tài)性位點(diǎn)改變已有文獻(xiàn)報道，但在6位患者中發(fā)現(xiàn)的9個多態(tài)性位點(diǎn)未見報道(表2)。

注：1.腎癌組織DNA擴(kuò)增結(jié)果；2.Marker

表2 腎癌患者mtDNA D-loop區(qū)多態(tài)性變化

3 討論

目前已證實(shí)在多種腫瘤細(xì)胞中都存在mtDNA的突變，其原因主要涉及2個發(fā)病相關(guān)機(jī)制：mtDNA突變后導(dǎo)致的非隨機(jī)分離和(或)mtDNA突變引起的凋亡過程改變。當(dāng)正常細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)mtDNA突變時，該細(xì)胞正常能量代謝受到影響，細(xì)胞為維持代謝平衡，經(jīng)多次分裂，采用非隨機(jī)分離的方式，將突變的mtDNA分子集中到某一子細(xì)胞中，這一子細(xì)胞由于含有大量的突變mtDNA，其呼吸作用受到抑制，最終導(dǎo)致死亡，其余不含突變mtDNA的細(xì)胞，則明顯獲得選擇性生長優(yōu)勢，細(xì)胞快速生長，組件失去控制，從而發(fā)生癌變；凋亡機(jī)制則強(qiáng)調(diào)mtDNA的突變導(dǎo)致線粒體內(nèi)各種蛋白合成、分布及轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生異常，線粒體內(nèi)膜的膜電位及通透性也受到影響，原本結(jié)合在線粒體內(nèi)膜上細(xì)胞色素C(cytochrome C)也向線粒體外側(cè)轉(zhuǎn)移，進(jìn)而激活內(nèi)源性凋亡途徑[8]。

由于外界環(huán)境和自身遺傳機(jī)制的共同作用，mtDNA的高突變率主要發(fā)生在D-loop區(qū)，目前實(shí)驗(yàn)證實(shí)：在正常人群中，非相關(guān)個體間的mtDNA中會有約0.3%(50個)的核苷酸序列互不相同，且絕大部分分布在D-loop區(qū)及非編碼區(qū)(Non-Codingregion，NC)[9]。本文結(jié)果顯示在20例腎癌患者細(xì)胞的mtDNA的D-loop區(qū)中共發(fā)現(xiàn)了206個多態(tài)性變化，與基因庫記載相比對，亦有9個新的多態(tài)性位點(diǎn)，可見mtDNA的D-loop區(qū)是一個具有高度多態(tài)性及高度突變性的片段。Fliss等[10]報道D-loop區(qū)突變率在頭頸部腫瘤、肺癌和膀胱癌中的比例分別為3/13、5/13和4/14；Habano等[11]在對45對結(jié)腸癌患者癌細(xì)胞和正常組織mtDNA突變進(jìn)行檢測時發(fā)現(xiàn)，44%(20/45)D-loop區(qū)存在CA不穩(wěn)定和多聚C(PolyC)不穩(wěn)定；Burgart等[12]通過對32例胃腺瘤患者癌細(xì)胞mtDNA也進(jìn)行了突變檢測，發(fā)現(xiàn)12.5%(4/32)D-loop區(qū)突變的原因是由于50bp缺失造成的，這說明D-loop區(qū)的改變在不同的腫瘤中是存在差異的。

核基因組和線粒體基因組信息交換的樞紐是D-loop區(qū)，其在mtDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄控制中也起著重要作用。雖然目前不能完全確定D-loop區(qū)的變異與腫瘤的發(fā)生直接相關(guān)，但可以證實(shí)mtDNA的D-loop區(qū)具有高度的多態(tài)性及突變性。由于劍橋mtDNA序列據(jù)庫中的序列信息來源于西方人群，因此不排除mtDNA的D-loop區(qū)多態(tài)性及突變性有地域、國家和人種間的差異。目前有研究認(rèn)為：核微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability，MSI)可能會導(dǎo)致編碼區(qū)發(fā)生突變，所以mtDNA的突變是通過某些核基因的改變而發(fā)揮作用的，也有可能是兩者協(xié)同作用共同參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此，腫瘤細(xì)胞中mtDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄水平的變化可能與mtDNA的NC區(qū)的突變有關(guān)。探明mtDNA不同位點(diǎn)突變所導(dǎo)致的相應(yīng)生物功能上的改變，這將為腫瘤的早期診斷及藥物治療提供新的依據(jù)，具有重要的理論與臨床意義。

綜上所述， 腎癌組織線粒體 DNA D-環(huán)區(qū)具有高度多態(tài)性和高突變率，該區(qū)的基因突變可能與腎癌的發(fā)生具有相關(guān)性。線粒體功能紊亂是腫瘤發(fā)生的表現(xiàn)之一，可能成為腫瘤診斷和治療的新方法，但要應(yīng)用于臨床，仍有一些問題有待解決。

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