黃 燕 丁 罡 陳 峰 陸云姝 張 明 梁洪享 吳克瑾

乳腺癌是目前最常見(jiàn)的女性惡性腫瘤，是婦女死亡的頭號(hào)殺手，嚴(yán)重威脅女性的身心健康[1]。TBX3基因是屬于調(diào)控發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，它與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[2]，它在乳腺癌、肝癌、肺癌、惡性黑色素瘤等多種腫瘤中高表達(dá)[3-6]。TBX3基因與乳腺癌的分子指標(biāo)ER、PR、Her-2的相關(guān)性研究已成為乳腺癌研究的熱點(diǎn)之一[5-6]，但它與乳腺癌分子亞型的相關(guān)性研究較少，尚無(wú)有相關(guān)報(bào)道，TBX3與乳腺癌的分子亞型及預(yù)后的關(guān)系尚不明確。本實(shí)驗(yàn)研究TBX3基因在乳腺癌組織中的表達(dá)水平與ER、PR、Her-2、Ki-67等指標(biāo)表達(dá)關(guān)系的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究它與乳腺癌分子亞型的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2011年1月-2013年12月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院行手術(shù)切除的102例乳腺癌病例，臨床資料完整，術(shù)前未行放化療或靶向治療，病理標(biāo)本保存完好。102例乳腺癌患者均為女性，年齡38～93歲，平均年齡61.90歲，≤65歲60例，>65歲42例；臨床分期(102例中96例行術(shù)后分期，6例因行單純切除術(shù)未能分期)：Ⅰ期45例，Ⅱ期31例，Ⅲ期20例；月經(jīng)情況：未絕經(jīng)24例，絕經(jīng)78例；免疫組化：ER(-)32例，ER(+)70例；Her-2(-)40例，Her-2(+)62例；Ki-67低表達(dá)(<14%)49例，Ki-67高表達(dá)(≥14%)53例。luminal A型40例、luminal B型33例、Her-2陽(yáng)性型18例、Basal-like型11例。并選擇22例同期行手術(shù)的良性乳腺腫瘤及10例乳腺癌切緣陰性組織分別作為對(duì)照組。所有的標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋、切片備用。

1.2 主要試劑與方法

人TBX3多克隆抗體：abcam公司，英國(guó)。免疫組化二步法染色嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作,抗原修復(fù)采用高壓修復(fù)法，陰性對(duì)照組:PBS磷酸緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 陽(yáng)性結(jié)果判斷

免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)參考許良中[7]的免疫組化評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，光鏡下隨機(jī)觀察4～5個(gè)不重疊的高倍(×200)視野，計(jì)數(shù)100～200個(gè)細(xì)胞,細(xì)胞染色陽(yáng)性表達(dá)為境界清晰、突出于背景的棕黃色或棕褐色顆粒。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和著色強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，1%～30%為1分，31%～70%為2分，71%～100%為3分；著色強(qiáng)度：不著色為0分，淺棕色為1分，棕黃色為2分，棕揭色為3分。兩項(xiàng)分?jǐn)?shù)累計(jì)：0分為陰性(-)，1、2分為弱陽(yáng)性(+)，3、4分為陽(yáng)性(++)，5、6分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。結(jié)果分為陰性(-)及陽(yáng)性(+～+++)兩組進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SAS 8.02統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，乳腺癌與良性組織TBX3表達(dá)率的比較，臨床及病理因素中TBX3表達(dá)率的差異均采用χ2檢驗(yàn)，分子分型中各組之間的多重比較采用Nemenyi檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌與乳腺良性疾病組織中TBX3表達(dá)的差異

TBX3主要定位于細(xì)胞核，其陽(yáng)性表達(dá)為境界清晰、突出于背景的黃色或棕黃色。結(jié)果顯示TBX3在乳腺癌與乳腺良性腫瘤組織中的表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P=0.0052<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 乳腺癌與乳腺良性腫瘤組織中TBX3表達(dá)(例，%)

2.2 TBX3在乳腺癌與切緣陰性的癌旁組織中表達(dá)情況

102例乳腺癌組織中，TBX3表達(dá)陽(yáng)性率為75.49%；10例切緣陰性的癌旁組織中，TBX3表達(dá)陽(yáng)性率為30.00%；經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，TBX3在乳腺癌與切緣陰性的癌旁組織中的表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P=0.0055<0.05)

2.3 TBX3與乳腺癌臨床病理因素的關(guān)系

本組結(jié)果顯示，TBX3表達(dá)與患者年齡、有無(wú)絕經(jīng)、Her-2狀態(tài)無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)，與乳腺癌臨床分期、ER狀態(tài)及Ki-67值有顯著相關(guān)性(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 TBX3表達(dá)與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例，%)

2.4 TBX3表達(dá)與乳腺癌組織分子分型的關(guān)系

本組結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示在不同分子亞型乳腺癌組織中TBX3表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值=0.0200，P<0.05)，見(jiàn)表3，Basal-like型乳腺癌TBX3陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于另外3種分子亞型，結(jié)果還顯示TBX3表達(dá)Basal-like型與luminal A型、luminal B型比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；luminal A型與luminal B型、Basal-like型與Her-2陽(yáng)性型、luminal A型與Her-2陽(yáng)性型、luminal B型與Her-2陽(yáng)性型間TBX3表達(dá)比較，無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表3 不同分子亞型乳腺癌中TBX3表達(dá)情況(例，%)

3 討論

乳腺癌是一個(gè)多基因突變驅(qū)動(dòng)的疾病，目前新發(fā)現(xiàn)的與乳腺癌相關(guān)的癌基因包括AKT2,ARID1B,CASP8,CDKN1B,MAP3K1,MAP3K13,NCOR1,SMARCD1 和TBX3等[8-9]。TBX基因家族也稱T-box，它具有高度保守的DNA結(jié)合區(qū)—T區(qū)，T區(qū)具有回文結(jié)構(gòu)的雙鏈DNA的兩個(gè)位點(diǎn)，其中的一個(gè)位點(diǎn)與靶基因的啟動(dòng)子特點(diǎn)序列相結(jié)合形成半位結(jié)合體，這個(gè)半位結(jié)合體通過(guò)與不同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合發(fā)揮不同的作用[10]。人類對(duì)TBX3的認(rèn)識(shí)首先是在對(duì)尺骨-乳腺綜合癥(ulnar-mammary syndrome，UMS)的研究中逐漸發(fā)現(xiàn)的，UMS是由于TBX3突變或缺失引起的一種嚴(yán)重的家族性顯性遺傳病，是由于TBX3基因發(fā)生點(diǎn)突變，引起所表達(dá)的TBX3蛋白碳端的抑制區(qū)缺失，導(dǎo)致TBX3功能障礙，臨床上主要表現(xiàn)為乳腺、四肢發(fā)育障礙伴心臟畸形等先天性缺陷[11-13]。

TBX3不但與乳腺的發(fā)育有關(guān)，還與乳腺癌的形成和進(jìn)展相關(guān)，國(guó)內(nèi)學(xué)者[14]使用熒光定量PCR的方法比較了51例新鮮乳腺癌及相應(yīng)的癌旁組織TBX3表達(dá)的情況，發(fā)現(xiàn)TBX3基因在癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，葉海英等[15]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中Tbx3基因的陽(yáng)性率為73.58%，明顯高于正常乳腺組織中的陽(yáng)性率14.29%，ER陽(yáng)性乳腺癌組織中TBX3基因的陽(yáng)性率為84.38%，明顯高于ER陰性的陽(yáng)性率57.14%；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌組織中TBX3基因的陽(yáng)性率為86.21%，明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽(yáng)性率58.33%(14/24)；Her-2陽(yáng)性乳腺癌組織中TBX3基因的陽(yáng)性率為93.75%，明顯高于Her-2陰性的陽(yáng)性率64.86%，Douglas等[5]研究亦表明TBX3在分期較晚的乳腺癌中高度表達(dá)，這說(shuō)明TBX3與乳腺癌有關(guān)，亦初步證實(shí)了TBX3與乳腺癌分子標(biāo)記物ER、PR、Her-2之間的相關(guān)性。我們的研究結(jié)果與鄧軍[6]、葉海英等[15]的研究結(jié)論相仿，認(rèn)為TBX3基因與乳腺癌有關(guān)，并且在中晚期、ER陽(yáng)性、Ki-67過(guò)表達(dá)的乳腺癌中高表達(dá)，這提示TBX3基因與乳腺癌的預(yù)后因素有關(guān)。

乳腺癌根據(jù)分子水平為基礎(chǔ)的分子亞型已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床，并作為指導(dǎo)制定治療方案、判斷療效、預(yù)測(cè)預(yù)后的重要標(biāo)準(zhǔn)之一，目前臨床上常用的乳腺癌分子分型方法為2011年《St.Gallen早期乳腺癌初始治療國(guó)際專家共識(shí)》中提出的4分法：luminal A型、luminal B型、人表皮生長(zhǎng)因子受體2過(guò)表達(dá)型、基底細(xì)胞樣型。具體每型的分子特征是：①luminal A型：免疫組織化檢測(cè)結(jié)果為ER 陽(yáng)性或/和PR陽(yáng)性，Her-2陰性，Ki-67<14%[16]。luminal A型是乳腺癌最為常見(jiàn)的類型，其發(fā)病率占乳腺癌 40%～50%，并且預(yù)后較其它亞型最好[17]。②luminal B型：免疫組織化檢測(cè)結(jié)果為ER陽(yáng)性或PR陽(yáng)性，Her-2陽(yáng)性；或者ER陽(yáng)性或/和PR陽(yáng)性，Her-2陰性，Ki-67≥14%。luminal B 型發(fā)病率約占乳腺癌的 8%，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)最高[18]。③Her-2過(guò)表達(dá)型：分子特征為ER、PR陰性，HER-2 陽(yáng)性，Ki-67多為高表達(dá)。此型患者的 5 年無(wú)病生存和總生存率最差[19]。④基底細(xì)胞樣型乳腺癌(basal-like breast carcinoma，BLBC)：BLBC的分子特征為ER(-)和 PR(-)/HER-2(-)，主要表現(xiàn)為三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)，即：雌激素受體(ER) 、孕激素受體(PR) 、人表皮生長(zhǎng)因子受體 2(Her-2) 均為陰性表達(dá)的乳腺癌。占乳腺癌的 8%～20%，臨床表現(xiàn)為高度侵襲性，較多發(fā)生局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，較少發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后最差[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，TBX3在乳腺癌四種分子亞型中的表達(dá)是不同的，從結(jié)果數(shù)據(jù)可以看出：TBX3在Basal-like型乳腺癌中低表達(dá)，在luminal A型、luminal B型乳腺癌中高表達(dá)，這提示TBX3與luminal A型、luminal B型乳腺癌的關(guān)系密切，可作為luminal型乳腺癌惡性標(biāo)志物之一，而對(duì)Basal-like型關(guān)系不密切，不能作為其惡性標(biāo)志物。TBX3基因與乳腺癌預(yù)后有關(guān)，但是否能作為乳腺癌預(yù)后因子之一，還有待于進(jìn)一步隨訪及行預(yù)后分析。

綜上所述，TBX3基因與乳腺癌的關(guān)系密切，TBX3在乳腺癌組織中的表達(dá)與腫瘤分期、ER、Ki-67的狀態(tài)、分子亞型有關(guān)，但由于腫瘤信號(hào)途徑的錯(cuò)綜復(fù)雜，TBX3在腫瘤中形成、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過(guò)程中的信號(hào)通路仍不十分清晰，相信隨著對(duì)TBX3基因進(jìn)一步深入的研究，TBX3基因?qū)?lái)有望成為治療腫瘤的新靶點(diǎn)[21]。

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