段翠翠，王慶國，王為光，鮑瑩瑩，張 純

（佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯154003）

白血病是一種血液系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴重危害著人類的健康。我國白血病發(fā)病率為2.76／10萬。在惡性腫瘤死亡率中，白血病居第6位（男性）和第8位（女性）［1］。它同實體腫瘤一樣，腫瘤細胞的過度增殖和凋亡受抑制是其發(fā)生發(fā)展的重要機制［2］。凋亡抑制蛋白（IAP）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類蛋白家族，其可以對抗各種凋亡誘導(dǎo)因素的作用，抑制細胞凋亡，與腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。至今為止人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了8個IAP家族成員，研究發(fā)現(xiàn)它的抗凋亡能力遠遠超過于Bc1-2家族，在腫瘤疾病的發(fā)生機制中發(fā)揮著重要的作用［3］，而XIAP的生物學(xué)機制及結(jié)構(gòu)是IAP家族中研究最為明確的凋亡抑制蛋白［4］，而且其在該家族中被認為是最強、最有效的Caspase抑制物。Caspase-3是重要的凋亡執(zhí)行者之一，在細胞凋亡過程中處于中心地位，是細胞凋亡的主要效應(yīng)因子［5，6］，Caspase-3被激活后能裂解大量的底物，包括抗凋亡成分及結(jié)構(gòu)蛋白等誘導(dǎo)的細胞凋亡，在腫瘤的發(fā)生中起著重要的作用。本研究應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)方法，檢測AL患者及健康成人骨髓細胞中XIAP、Caspase-3 mRNA的表達，探討XIAP及Caspase-3在AL發(fā)生、發(fā)展過程中的作用以及二者相關(guān)性，為臨床診療與預(yù)后提供有價值的參考指標。

1 資料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 病例組（AL組）：AL患者50例均系在佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科自2012-03～2013-06住院治療患者，男24例，女26例，年齡18～74歲，中位年齡48歲。包括初治32例，其中急性淋巴細胞白血病（ALL）10例，急性髓細胞白血?。ˋML）22例；復(fù)發(fā)18例，其中ALL7例，AML 11例，AL患者均接受兩個正規(guī)療程化療后，以骨髓緩解率作為療效的判斷標準。以上病人的診斷及療效標準均參照張之南主編的《血液病診斷及療效標準》［7］。

1.1.2 對照組（N組）：選取佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診健康體檢的成人共30例，男18例，女12例，年齡26～58歲，中位年齡47歲。

1.2 單個核細胞分離及總RNA提取

無菌操作采集白血病患者骨髓液2m L后肝素抗凝。用人淋巴細胞分離液（Ficoll-Paque PREMIMU，密度為1.077g／m L，上海新睿生物科技有限公司）2m L，以2 000r／min離心15min，分離單個核細胞。然后應(yīng)用PBS液洗滌5×106個單個核細胞，加入0.8mL Trizol液 （Invitrogen公司），混勻后在-80℃下保存。所有操作要嚴格按照Invitrogen公司的試劑盒的說明書進行，提取上述單個核細胞中的總RNA，RNA的完整性采用變性凝膠電泳檢測，并使用Beckman DU640蛋白核酸分析儀進行RNA濃度和純度（A260／A280的值在1.8～2.0）的檢測。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄、聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）分析

1.3.1 逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司，Trizol試劑提取細胞總RNA，應(yīng)用752型紫外分光光度計測定260nm的吸收值來確定RNA的含量，以O(shè)D260相當于40Lg RNA來計算RNA的產(chǎn)率，OD260在1.8～2.0時可以認為提取的RNA純度很高。RT-PCR采用一步法，按操作手冊進行。內(nèi)參照β-action及PCR引物都是由上海生工生物技術(shù)有限公司提供的。RT-PCR反應(yīng)條件：cDNA合成和預(yù)變性1個循環(huán)：39℃15min，94℃2min；PCR擴增35個循環(huán)：94℃15s，59℃30s，72℃1min，終延伸1個循環(huán)72℃10min。制備1.7%瓊脂糖凝膠，取10μLPCR擴增產(chǎn)物進行電泳，在紫外燈下進行拍照，并采用天能全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)進行拍照并進行灰度掃描分析，通過比較電泳條帶的光密度值，獲得Caspase-3及XIAP m RNA的相對表達量，結(jié)果以均數(shù)±標準差（）表示。

1.3.2 引物的序列XIAP：XIAP上游引物：5'-CCGTGCGGTGCTTTAGTTGTC-3'，下 游 引 物：5'-ATGGCAGGGTTCCTCGGGTAT-3'，擴增產(chǎn)物的長度為301 bp；Caspase-3引物：上游5'TGTCGATGCAGCAAACCTCA 3'，下游5'TTTCAGCATGGCACAAAGCG 3'，擴增產(chǎn)物469 bp；以β-actin作為內(nèi)參照，其上游引物5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下游引物5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'，擴增產(chǎn)物的長度為205 bp。

1.3.3 PCR產(chǎn)物分析取10m L擴增產(chǎn)物與2μL 6×Loading Buffer混合后在1.7%瓊脂糖凝膠中120V電泳30min。急性白血病初治組、和復(fù)發(fā)組及對照組在205bp和301bp處均可見一條亮帶，分別為β-actin和XIAP m RNA；在469 bp處為Caspase-3 mRNA。應(yīng)用紫外線透射儀觀察并且拍照，經(jīng)Metamorph ImagingSight軟件進行分析并且讀取光密度值，取XIAP mRNA／B-actin、Caspase-3 m RNA／β-actin光密度比值進行半定量分析，各標本重復(fù)3次，取平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。XIAP、Caspase-3的相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)進行相關(guān)分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AL組XIAP及Caspase-3的表達

AL組病人與對照組病人均表達不同水平的XIAP及Caspase-3，見圖1、圖2。AL組XIAP的表達水平為（0.679±0.132），明顯高于對照組（0.486±0.059），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；AL組Caspase-3的表達水平為（0.178±0.057），明顯高于對照組（0.369±0.062），差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）。兩者呈負相關(guān) （r=-0.837，P＜0.05）。而ALL與AML病人XIAP及Caspase-3表達水平差異無顯著性 （P＞0.05）。

（M：Marker；1對照組；2、3：初治 AL組；4、5：復(fù)發(fā) AL組）圖1 XIAP基因RT-PCR檢測

（M：Marker；1：對照；2、3：初治 AL；4、5：復(fù)發(fā) AL）圖2 Caspase-3基因RT-PCR 檢測

2.2 XIAP和Caspase-3在初治AL組和復(fù)發(fā)AL組中的表達

XIAP在初治AL組的表達水平分別為（0.596±0.031），明顯低于復(fù)發(fā)AL組（0.828±0.107）差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Caspase-3在初治AL組的表達水平分別為（0.207±0.043），明顯高于復(fù)發(fā) AL組（0.126±0.039）差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 XIAP及Caspase-3的表達與患者臨床療效的關(guān)系

根據(jù)急性白血病初治組XIAP及Caspase-3的表達水平 （χ1=0.596；χ2=0.206）將其分為高、低表達組（XIAP／β-actin≥0.596為高表達，＜0.596為低表達；Caspase-3／β-actin≥0.206為高表達，＜0.206為低表達）。XIAP高表達組經(jīng)過正規(guī)治療兩個療程完全緩解率為26.7%（4／15），而XIAP低表達組完全緩解率為64.7%（11／17），兩者比較差異有顯著性（χ21=4.630，P＜0.05）；Caspase-3高表達組經(jīng)過正規(guī)治療兩個療程完全緩解率為68.8%（11／16），而Caspase-3低表達組完全緩解率為25.0%（4／16），兩者比較差異有顯著性 （χ22=6.149，P＜0.05）。

3 討論

腫瘤細胞凋亡受抑在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著極其重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)不同的凋亡途徑都是通過激活Caspase的完成的［8］。而Caspase-3被認為是Caspase級聯(lián)反應(yīng)中最為重要的效應(yīng)酶，在凋亡途徑最后的執(zhí)行階段常常起到不可替代的核心作用，其被稱為凋亡的”執(zhí)行者”［9］。鑒于Caspase-3在凋亡中發(fā)揮的關(guān)鍵作用，它已經(jīng)成為了近幾年凋亡研究的熱點。

XIAP系分子結(jié)構(gòu)研究得最清楚的凋亡抑制蛋白IAP家族的一員，它是內(nèi)源性凋亡抑制蛋基因家族中最有效的Caspase抑制劑［11］，大量研究表明，XIAP在腫瘤細胞的表達水平顯著高于正常組織，提示其過度表達可以抑制多種刺激誘導(dǎo)的細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)XIAP可以通過其BIR2、BIR3分別抑制Caspase-3、Caspase-7的活性及Caspase-9的活性及環(huán)指結(jié)構(gòu)域泛素降解Caspases等多種途徑而發(fā)揮抗凋亡作用。

本研究證實，在急性白血病患者骨髓液中XIAP m RNA的表達明顯高于正常對照組，caspase-3 mRNA的表達明顯低于對照組，有統(tǒng)計學(xué)意義，說明二者在AL的發(fā)生發(fā)展中關(guān)系密切，二者可能是白血病細胞凋亡信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中的最重要的環(huán)節(jié)之一。并且發(fā)現(xiàn)XIAP和Caspase-3的表達具有負相關(guān)性，二者經(jīng)Spearman相關(guān)分析顯示r=-0.837，P＜0.05。AL初治組XIAP的表達水平低于復(fù)發(fā)組XIAP表達水平（P＜0.05）；AL初治組Caspase-3的表達水平高于復(fù)發(fā)組Caspase-3表達水平，而且XIAP高表達組經(jīng)過兩個正規(guī)療程化療后完全緩解（CR）率低于低表達組（P＜0.05），Caspase-3高表達組的完全緩解率高于低表達組（P＜0.05），提示二者的表達與化療藥物的敏感性有一定的聯(lián)系，XIAP的高表達及Caspase-3低表達可能是導(dǎo)致急性白血病細胞對化療藥物不敏感的原因之一。實驗中ALL組與AML組比較，XIAP、Caspase-3表達水平無統(tǒng)計學(xué)意義，提示XIAP、Caspase-3與AL患者的臨床分型可能無關(guān)，這一結(jié)論尚有待于進一步擴大病例數(shù)繼續(xù)研究。因此，XIAP、Caspase-3可能參與了急性白血病的發(fā)生發(fā)展，可為急性白血病的臨床診療與預(yù)后提供有價值的參考指標。

［1］于廣晴，張家軍，石亞男.NPRL2在急性白血病中的表達［J］.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2011，34（1）：50-51

［2］張會營，江彩玉，管洪.急性白血病病人XIAP表達及其臨床意義［J］.齊魯醫(yī)學(xué)雜志，2011，26（3）：206-208

［3］劉建剛，管洪在，盧偉.急性白血病病人白血病細胞Survivin基因的表達及其臨床意義［J］.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2007，43（4）：302-304

［4］Deveraux Q L，Reed J C.IAP family proteins-supressorsof apoptosis［J］.Genes Dev，1999，13（3）：239-252

［5］Akao Y，Yamada H，Nakagawa Y.Arsenic-induced apoptosis inmalignant cells in vitro［J］.Leuk Lymphoma，2000，37：53-63

［6］AnuradhaCD，Kanno S，Hirano S.Oxidative damage ofmitochondriais a preliminary step toCaspase-3 activation in fluoride-induced apoptosisin HL-60 cells［J］.Free Radic Biol Med，2001，31：367-373

［7］張之南.血液病診斷及療效標準［M］.第2版.北京：科學(xué)出版社，1998，168-194，219-227

［8］李東，霍鋼，王亮，等.侵襲性垂體腺瘤smac，XIAP，caspase-3的表達［J］.中國神經(jīng)精神疾病雜志，2009，35（11）：673-676

［9］Meggiato T，Calabrese F，De Cesare CM，et al.C-jun and cpp32（caspase3）in human pancreatic cancer：relation to cell prolifera-tion and death［J］.Pancreas，2003，26（1）：65-70

［10］于濤，高慶紅，溫玉明.血管瘤發(fā)病機制的研究進展［J］.國際口腔醫(yī)學(xué)雜志，2007，34（2）：122-124

［11］Deveraux QL，LeoE，Stennicke HR，et al.Cleavage ofhuman inhibitorof apoptosis protein XIAP Results in fragmentswith distinct specific-ities for caspases［J］.EMBO J，1999，18（19）：5242-5251