李雙月，王哲敏，陳若霖，戚 媛，劉 爽，樸豐源

(大連醫(yī)科大學(xué)勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室，遼寧大連 116044)

體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究

李雙月，王哲敏，陳若霖，戚 媛，劉 爽，樸豐源

(大連醫(yī)科大學(xué)勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室，遼寧大連 116044)

目的 對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)進(jìn)行分離、培養(yǎng)與鑒定，并探討全反式維甲酸(retinoic acid，RA)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor，basic，bFGF)和表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)聯(lián)合誘導(dǎo)BMSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞的可行性。方法 全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)BMSCs，觀察細(xì)胞形態(tài)及生長增殖情況;流式鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD34、CD90;選用第3代細(xì)胞，經(jīng)RA、bFGF和EGF聯(lián)合誘導(dǎo)后，細(xì)胞免疫化學(xué)染色檢測神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolasen，NSE)的表達(dá)。結(jié)果 體外培養(yǎng)的BMSCs呈成纖維細(xì)胞樣，第3、4、5代BMSCs的生長曲線均呈S形，活性無明顯差異。BMSCs的均一性較好，第3代細(xì)胞CD29、CD90陽性率均在90%以上，而CD34陽性率僅為0.58%;BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)后分化為神經(jīng)細(xì)胞，并表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志NSE。結(jié)論 成功建立BMSCs的體外培養(yǎng)體系，所得細(xì)胞純度高、生物學(xué)特征穩(wěn)定，并可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞，為移植治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;神經(jīng)細(xì)胞;分化;誘導(dǎo);培養(yǎng)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是骨髓中的非造血類干細(xì)胞，有較強(qiáng)的可塑性，不僅能被誘導(dǎo)分化為骨、軟骨、脂肪等中胚層細(xì)胞，還能分化為神經(jīng)細(xì)胞等外胚層細(xì)胞和肝細(xì)胞等內(nèi)胚層細(xì)胞［1-3］。BMSCs取材方便，能在體外大量擴(kuò)增，分化的目的細(xì)胞具有可移植性，對于治療腦卒中、早老性癡呆和帕金森病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病都具有重要意義［4-5］。本研究采用全反式維甲酸(retinoic acid，RA)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor，basic，bFGF)和表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)的聯(lián)合誘導(dǎo)方式，誘導(dǎo)體外分離培養(yǎng)的BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞定向分化，旨在探討B(tài)MSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的可行性，為BMSCs移植治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

Wistar大鼠，4～5周齡，由大連醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供［許可證號SCKK(遼)2002-0002］。

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)，RA、大鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolasen，NSE)、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素(Sigma公司)，二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(上海生工生物工程有限公司)，bFGF、EGF(Peprotech公司)，F(xiàn)ITC -CD29 抗體、PE-CD34抗體、PE-CD90抗體(e-BIOSCIENCE公司)。

1.2 方 法

1.2.1 BMSCs的分離、純化和培養(yǎng):大鼠脫臼處死，75%乙醇浸泡消毒10 min，無菌條件下完整剝離股骨及脛骨，暴露骨髓腔并反復(fù)沖洗，尤其是干骺端。將沖出的骨髓細(xì)胞過篩網(wǎng)制成單細(xì)胞懸液，離心后用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸，2×109/cm2細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，于37℃、CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種24 h后全量換液，以后3 d換液1次，待細(xì)胞達(dá)到80% ～90%融合，0.25%胰酶消化并傳代，利用差速貼壁法逐步純化BMSCs。

1.2.2 BMSCs增殖能力的檢測:將生長狀態(tài)良好的BMSCs按1×104/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，每組各6復(fù)孔，每3 d換液1次，應(yīng)用MTT法檢測其生長增殖能力。從培養(yǎng)第1天到第7天，每天棄去原培養(yǎng)液，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)溶液，37℃孵育4 h，小心棄去上清液，各孔加入150 μL DMSO，微量振蕩器震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解后，酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處各孔吸光度(A)值，以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.3 BMSCs表面標(biāo)記物表達(dá)的鑒定:采用流式細(xì)胞儀檢測CD29、CD34、CD90的表達(dá)，取第3代生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，1000 r/min室溫離心5 min，PBS洗滌細(xì)胞3次，并輕輕吹打制成單細(xì)胞懸液，各待檢測的樣本依次加入單克隆抗體CD29、CD90、CD34，同時每管樣品設(shè)立同型陰性對照，4℃避光孵育20 min，PBS洗滌細(xì)胞3次，以去除未結(jié)合抗體，用500 μL PBS重懸細(xì)胞后上機(jī)檢測分析。

1.2.4 BMSCs誘導(dǎo)分化:取第 3 代 BMSCs，接種于6孔板，生長密度達(dá)到 60%時，換成誘導(dǎo)培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS+1 μmol/L ATRA+20 ng/mL bFGF+20 ng/mL EGF)。37℃、CO2飽和濕度靜置培養(yǎng)。

1.2.5 細(xì)胞免疫化學(xué)染色:培養(yǎng)細(xì)胞在誘導(dǎo)分化48 h、72 h分別進(jìn)行細(xì)胞免疫化學(xué)染色，誘導(dǎo)細(xì)胞PBS洗3次，冷丙酮固定15 min，PBS洗3次，0.5%Triton X-100孵育20 min，PBS洗3次，山羊血清封閉20 min，棄去血清，加入 NSE 抗體(1∶500)，37 ℃孵育3 h，PBS洗3次，滴加二抗，37℃孵育15 min后DAB顯色，顯微鏡下觀察。鏡下隨機(jī)選取4個視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs分離培養(yǎng)

細(xì)胞接種時呈懸浮狀態(tài)，24 h后少量細(xì)胞貼壁，細(xì)胞呈圓形;72 h后大部分細(xì)胞貼壁，形態(tài)變短梭形、多角形;4、5 d左右形成細(xì)胞集落，細(xì)胞伸出長短不一、粗細(xì)不均的突起(圖1a);10 d左右細(xì)胞集落融合成片，鋪滿瓶底80%，可進(jìn)行首次傳代(圖1b)，傳3代后，細(xì)胞形態(tài)均一，為成纖維細(xì)胞樣的長梭形、多角形，排列有序(圖1c)。

圖1 BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察(×100)Fig 1 Morphology of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)at different phases(×100)

2.2 BMSCs的鑒定

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，BMSCs均一性較好，3代細(xì)胞即可達(dá)到90.10%的細(xì)胞CD29表達(dá)陽性，96.61%的細(xì)胞CD90表達(dá)陽性，而僅0.58%的細(xì)胞CD34表達(dá)陽性，證明培養(yǎng)所得細(xì)胞為BMSCs。見圖2。

圖2 BMSCs表面標(biāo)志物表達(dá)Fig 2 Surface markers expression of BMSCs

2.3 生 長

細(xì)胞接種1 d后開始少量增殖，潛伏期為24 h，3～5 d細(xì)胞生長達(dá)指數(shù)生長期，接種后6 d增殖逐漸減緩，7 d達(dá)到高峰，然后生長逐漸緩慢，進(jìn)入平臺期。第3、4、5 代(P3、P4、P5)細(xì)胞的生長曲線接近，沒有明顯差異(圖3)。

2.4 神經(jīng)細(xì)胞分化檢測

細(xì)胞誘導(dǎo)2 h即可見體積變小，形成雙極或多極的細(xì)胞體，細(xì)胞質(zhì)以細(xì)胞核為中心收縮，周圍的胞質(zhì)收縮形成細(xì)胞的突起，誘導(dǎo)48 h時，染色可見(33.95±3.12)%細(xì)胞 NSE陽性表達(dá)，誘導(dǎo) 72 h時，NSE陽性表達(dá)細(xì)胞增至(51.86 ±2.89)%，NSE陽性細(xì)胞間存在突觸聯(lián)系。未誘導(dǎo)對照組細(xì)胞保持長梭形和多角形，未見NSE陽性細(xì)胞出現(xiàn)。

圖3 BMSCs的生長曲線Fig 3 The growth curve of BMSCs

圖4 細(xì)胞免疫化學(xué)檢測神經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)胞的NSE表達(dá)(×100)Fig 4 The expression of NSE detected by Cytochemistry(×100)

3 討論

高度特化的神經(jīng)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)和功能單位，一旦大腦或脊髓中的神經(jīng)細(xì)胞損傷或缺失便會引起一系列的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，且神經(jīng)細(xì)胞受損后往往不能重建正常的樹突和軸突聯(lián)系。而內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞在神經(jīng)受損時因量少且缺乏正向信號的激活，無法進(jìn)行組織修復(fù);外源性神經(jīng)干細(xì)胞來源受限、涉及倫理學(xué)爭議及免疫排斥等諸多問題，存在應(yīng)用的局限性。1999年，Kopen等［6］首次發(fā)現(xiàn)BMSCs新生鼠腦移植后可分化為神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞;2000 年，Woodbury等［7］首次證實(shí) BMSCs可在體外向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化。BMSCs如用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病，因其具有取材方便、易于分離和擴(kuò)增、免疫原性低、可自體移植等優(yōu)勢，比其他細(xì)胞具有顯著優(yōu)勢［8-9］。

基于BMSCs可能分化為神經(jīng)樣細(xì)胞從而促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)功能恢復(fù)的假設(shè)，本課題組參考國外文獻(xiàn)的成功報道，并結(jié)合實(shí)際情況設(shè)計(jì)了RA、bFGF和EGF聯(lián)合誘導(dǎo)的方案。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在RA、bFGF和EGF聯(lián)合誘導(dǎo)下，BMSCs在形態(tài)上發(fā)生近似神經(jīng)細(xì)胞的變化，而且免疫染色顯示部分細(xì)胞表達(dá)NSE，說明這部分細(xì)胞具有神經(jīng)細(xì)胞的特征。

RA、bFGF和EGF聯(lián)合誘導(dǎo)BMSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞的作用可能是通過以下幾方面實(shí)現(xiàn):(1)有研究表明，RA能催化胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元，并明顯增加神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量。RA能調(diào)控細(xì)胞的生長增殖及分化，有很強(qiáng)的誘導(dǎo)劑功能。RA能調(diào)節(jié)EGF反應(yīng)的神經(jīng)干細(xì)胞分化，增加神經(jīng)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的合成［10］。(2)EGF是有絲分裂的促進(jìn)因子，對神經(jīng)干細(xì)胞分裂有促進(jìn)作用，可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化，促進(jìn)神經(jīng)元軸突的延長和維持神經(jīng)元的存活［11］。(3)bFGF是體內(nèi)重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖并向神經(jīng)細(xì)胞分化，能維持神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞存活［12-13］。有文獻(xiàn)報道，bFGF 可能參與了 BMSCs向神經(jīng)元分化的啟動，并參與細(xì)胞的生長、發(fā)育和組織損傷的修復(fù)［14-15］。(4)bFGF和EGF對神經(jīng)前體細(xì)胞增殖具有協(xié)同作用，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化［16］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為下一步的細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了基礎(chǔ)，可通過將BMSCs分離培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞后，將其移植入損傷局部，并觀察其療效，以期為臨床應(yīng)用BMSCs移植治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Neuron-like cells differentiated from rat mesenchymal stem cellsin vitro

LI Shuang-yue，WANG Zhe-min，CHEN Ruo-lin，QI-Yuan，LIU Shuang，PIAO Feng-yuan
(Department of Occupational and Environmental Health，Dalian Medical University，Dalian116044，China)

［Abstract］ObjectiveTo isolate and culture rat bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)and induce them differentiate to neural cells.MethodsBMSCs were isolated from rats by wall sticking method.Then the cells were identified with morphology，proliferation and the surface markers.Neuron-like cells from BMSCs were induced by the combination of retinoic acid(RA)，fibroblast growth factor，basic(bFGF)and epidermal growth factor(EGF)，and their neuron specific enolasen(NSE)were detected by NSE immunohistochemistry.ResultsCultured BMSCs like fibroblast- shapedin vitro.Growth curves of the 3rd，4thand 5th -generation BMSCs and their activities were not significantly different.FCM detected that CD29 and CD90 were positively expressed，but CD34 was negatively expressed.The induced BMSCs showed neuronlike morphology and expressed NSE，the neuron marker.ConclusionWe have established an efficient and steady method to obtain BMSCs.BMSCs could differentiated into neurons which was an ideal source for clinical cell transplantation in treatment of nervous system diseases.

［Key words］mesenchymal stem cells;neuron;differentiate;induce;culture

R322.2

A

1671-7295(2014)01-0007-04

李雙月，王哲敏，陳若霖，等.體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究［J］.大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014，36(1):7 -10.

10.11724/jdmu.2014.01.02

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81102160，81273038)

李雙月(1978-)，女，黑龍江哈爾濱人，講師。

樸豐源，博士生導(dǎo)師，教授。E-mail:piaofy_dy@163.com

2013-09-15;

2014-01-02)