張晶+++++劉偉++++++陳云雨++++++劉宗英+++司書(shū)毅

[摘要] 目的 評(píng)價(jià)以酵母細(xì)胞為模式菌高通量篩選Pin1抑制劑的方法。 方法 以野生型酵母菌W303-1a和溫度敏感型突變株L94P為模式菌，篩選Pin1抑制劑；四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法檢驗(yàn)候選化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用；體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證候選化合物對(duì)Pin1的抑制作用；流式細(xì)胞儀檢測(cè)候選化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞周期和凋亡的阻滯和誘導(dǎo)作用；免疫印跡（Western Blotting）分析候選化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞中Cyclin D1和Pin1表達(dá)量的影響。 結(jié)果 候選化合物顯示出對(duì)溫度敏感型突變株的特異性抑制作用；MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)化合物能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖；酶學(xué)實(shí)驗(yàn)和Western Blotting共同闡釋了化合物對(duì)重組純化的人Pin1具抑制作用但并不影響Pin1蛋白的表達(dá)；流式結(jié)果表明化合物能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡和G0/G1期阻滯；化合物還能抑制腫瘤細(xì)胞中Cyclin D1的蛋白表達(dá)并呈劑量依賴性。 結(jié)論 首次發(fā)現(xiàn)Pin1為苯并呋喃衍生物抗腫瘤作用的靶點(diǎn)之一。

[關(guān)鍵詞] 酵母細(xì)胞；Pin1抑制劑；酶學(xué)分析；苯并呋喃衍生物

[中圖分類號(hào)] R739.5[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1673-7210（2014）06（a）-0004-06

Screening and activity evaluation for potential inhibitors of human Pin1

ZHANG Jing* LIU Wei* CHEN Yunyu LIU Zongying SI Shuyi▲

Research Institute of Pharmaceutical Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100050, China

[Abstract] Objective To evaluate potential small molecular inhibitors through high throughput screening (HTS) using budding yeast cells. Methods In vitro biochemical assay using purified recombinant human Pin1 was performed to test the inhibition of candidate determined by HTS using wild-type yeast cells and L94P temperature sensitive mutant. MTT proliferation assay was carried out to detect ZY0625′s cellular toxicity. Flow cytometric analysis was operated to assess ZY0625′s influence on cell cycle progression and apoptosis. Western Blotting was performed to determine the effects of candidate on Pin1 and Cyclin D1 expression. Results ZY0625 inhibited the growth of L94P temperature sensitive mutant more strongly than wild-type yeast cells, moreover ZY0625 inhibited purified recombinant human Pin1 in vitro without influencing the expression of Pin1 in tumor cells. Cell culture based tests of ZY0625 activity showed that ZY0625 potently inhibited the proliferation of human cancer cell lines. Flow cytometry confirmed that ZY0625 could induce apoptosis of tumer cells and modulate cell cycle distribution moderately with an elevated percentage of cells in G0/G1, as well. Like other Pin1 inhibitors, ZY0625 increased the protein expression of Cyclin D1 in a dose dependent fashion. Conclusion Pin1 is for the first time verified as one of the targets that contributes to the benzofuran derivatives' anticancer activity.

[Key words] Yeast cells; Pin1 inhibitor; Enzymatic assay; Benzofuran derivatives

1996年，Pin1作為屬于微小菌素蛋白家族的多肽脯氨?；悩?gòu)酶被首次報(bào)道[1]，它催化磷酸化的絲/蘇-脯氨酸基序異構(gòu)化，能多部位、多環(huán)節(jié)控制包括細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)錄和剪切、DNA復(fù)制檢驗(yàn)點(diǎn)、DNA損傷應(yīng)答、神經(jīng)元存活和干細(xì)胞發(fā)育等許多細(xì)胞過(guò)程[2-3]。Pin1功能紊亂能導(dǎo)致人類的多種疾病[4]，如老年癡呆癥和惡性腫瘤。Pin1不但在多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，而且對(duì)于腫瘤的發(fā)生具有極為重要的催化作用，被稱為腫瘤發(fā)生的催化分子，其總體效應(yīng)是導(dǎo)致癌信號(hào)被無(wú)限放大，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增殖失控[5-6]。抑制Pin1的功能或減少其表達(dá)將能有效地抑制其致癌途徑，被認(rèn)為是有潛力的腫瘤治療的靶點(diǎn)。但Pin1抑制劑的研究尚處于起步階段，尤其是小分子抑制劑的研究，發(fā)現(xiàn)新的Pin1小分子抑制劑不僅對(duì)于Pin1功能的深入研究有重大意義，也是研制新型抗腫瘤藥物的新途徑。

本研究通過(guò)高通量篩選，得到1個(gè)能抑制體外表達(dá)的人Pin1活性的苯并呋喃衍生物ZY0625，進(jìn)一步檢測(cè)化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、周期、蛋白表達(dá)的影響，首次發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了Pin1為苯并呋喃衍生物抗腫瘤作用的靶點(diǎn)之一，為其綜合應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑ZY0625（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所劉宗英提供，苯并呋喃類衍生物），RNA酶A（RNase A，美國(guó)Sigma公司），碘化丙啶（PI，美國(guó)Sigma公司），Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司），Pin1一抗、周期蛋白D1一抗（南京生物世界科技有限公司），噻唑藍(lán)（MTT，美國(guó)Sigma公司）。

1.1.2 菌株野生型菌株W303-1a（MATa，ura3-1，leu2-3，112trp-1，his3-11，15，can1-100，ade2-1），溫度敏感型突變株L94P（ess1 L94P in W303-1a background），均由佛羅里達(dá)州立大學(xué)王彥昶教授提供，25℃，酵母膏胨葡萄糖（YPD）中培養(yǎng)。

1.1.3 細(xì)胞株人肺癌細(xì)胞A549，人宮頸癌細(xì)胞Hela，人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，人骨肉瘤細(xì)胞U2OS，人肝癌細(xì)胞HepG2，人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞HT-29，人前列腺癌細(xì)胞PC3，人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞HCT116，上述細(xì)胞株均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所（以下簡(jiǎn)稱“本室”）保存。

1.1.4 主要儀器酶標(biāo)儀為美國(guó)PerkinElmer公司的EnVision，流式細(xì)胞儀為美國(guó) BD公司的FACSCalibur。

1.2 方法

1.2.1 利用釀酒酵母進(jìn)行Pin1抑制劑的高通量篩選于96孔板中加入196 μL YPD液體培養(yǎng)基，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（A600≈0.6）的L94P和303-1a分別加入到96孔板中，每孔2 μL，隔行加入；將樣品庫(kù)受試化合物[初始濃度為10 mg/mL，二甲基亞砜（DMSO）溶解]分別加入到L94P和303-1a中，每孔2 μL，使各化合物終濃度為10 μg/mL，并分別設(shè)立對(duì)照（不加任何化合物）和1%DMSO對(duì)照（檢測(cè)1%DMSO是否影響菌液生長(zhǎng)）。25℃ 140 r/min震蕩培養(yǎng)24 h，觀察突變株和野生型的生長(zhǎng)情況。陽(yáng)性化合物進(jìn)一步做稀釋梯度：0、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL（均采用DMSO溶解），按照上述方法測(cè)定最小抑制濃度（MIC）。

1.2.2 陽(yáng)性化合物ZY0625對(duì)Pin1體外抑制活性測(cè)定將緩沖液、底物、不同濃度的陽(yáng)性化合物ZY0625和糜蛋白酶加入到反應(yīng)體系中，最后加入足量體外表達(dá)純化的Pin1，設(shè)立對(duì)照（不加ZY0625）；充分混合，室溫孵育，使發(fā)光信號(hào)穩(wěn)定，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。在一定底物濃度下，通過(guò)對(duì)不同濃度的化合物ZY0625對(duì)Pin1活性的抑制率算出半抑制濃度（IC50）。

1.2.3 MTT法檢測(cè)陽(yáng)性化合物ZY0625細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中。細(xì)胞貼壁后加入梯度稀釋的陽(yáng)性化合物ZY0625，同一濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，設(shè)對(duì)照組（不加細(xì)胞只加培養(yǎng)基）和正常組（不加ZY0625）。于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，MTT孵育4 h，再加入DMSO震蕩15 min。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定579 nm波長(zhǎng)處吸收值。其中細(xì)胞抑制率（%） = 1 - [（OD加藥組-OD對(duì)照組）/（OD正常組-OD對(duì)照組）]×100%。計(jì)算陽(yáng)性化合物ZY0625的IC50。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)陽(yáng)性化合物ZY0625對(duì)細(xì)胞周期的影響設(shè)立加藥組（相同時(shí)間不同濃度或相同濃度不同時(shí)間陽(yáng)性化合物ZY0625孵育后的細(xì)胞）和對(duì)照組（不加ZY0625的細(xì)胞），分別以冰預(yù)冷的70%乙醇固定，4℃儲(chǔ)存過(guò)夜。PBS液洗滌、重懸細(xì)胞，加入RNase A，37℃恒溫孵育后加入PI，室溫下避光孵育，PBS洗滌，于1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5 顯微鏡下觀察陽(yáng)性化合物ZY0625對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響以5×105個(gè)/孔接種Hela細(xì)胞于6孔培養(yǎng)板，在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，設(shè)立加藥組（ZY0625終濃度為6.43 μmol/L，培養(yǎng)基稀釋)和對(duì)照組（不加ZY0625），繼續(xù)培養(yǎng)48 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.6 Western Blotting檢測(cè)陽(yáng)性化合物ZY0625對(duì)Pin1和Cyclin D1表達(dá)水平的影響 收集加藥組（相同時(shí)間不同濃度或相同濃度不同時(shí)間下陽(yáng)性化合物ZY0625作用的細(xì)胞）和對(duì)照組（不加ZY0625）的細(xì)胞，裂解后調(diào)整各組總蛋白濃度一致，取50 μg的細(xì)胞總蛋白點(diǎn)樣于15% SDS-PAGE凝膠，電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶封閉1 h，Pin1抗體、Cyclin D1抗體和β-actin抗體檢測(cè)，PBST洗膜，相應(yīng)二抗孵育，洗膜后滴加檢測(cè)液顯影拍照。

1.2.7 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)陽(yáng)性化合物ZY0625對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用收集加藥組（相同時(shí)間不同濃度或相同濃度不同時(shí)間陽(yáng)性化合物ZY0625作用）和對(duì)照（不加ZY0625）的細(xì)胞，4℃預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞兩次，用250 μL結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為1×106/mL；取100 μL的細(xì)胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V/FITC和10 μL 20 μg/mL的PI溶液；混勻后于室溫避光孵育；在反應(yīng)管中加400 μL PBS，流式細(xì)胞儀分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用方差分析。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 酵酒酵母模型篩選結(jié)果

由于基因突變，造成ess1蛋白功能部分受損，溫度敏感型突變株L94P在37℃下不能生長(zhǎng)，而野生型菌株303-1a可以生長(zhǎng)；但在適宜溫度下（25℃）L94P的ess1蛋白功能部分恢復(fù)，因此如果存在ess1抑制劑，則與303-1a相比，L94P受到的抑制作用更加明顯。利用酵母模型對(duì)本室的化合物庫(kù)進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)化合物ZY0625，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1，可以在10 μg/mL的濃度下抑制L94P的生長(zhǎng)，而303-1a的生長(zhǎng)卻完全不受影響。對(duì)酵母模型的MIC值分別為L(zhǎng)94P：5 μg/mL（25.71 μmol/L）和W303-1a：20 μg/mL（102.83 μmol/L）（DMSO稀釋），相差了3倍?？紤]到PPIase的高度保守性，該實(shí)驗(yàn)初步提示ZY0625可能也是人Pin1的抑制劑。

圖1 ZY0625的結(jié)構(gòu)

2.2 ZY0625可抑制腫瘤細(xì)胞增殖

MTT結(jié)果顯示，苯并呋喃類衍生物ZY0625可抑制多種腫瘤細(xì)胞系的增殖，隨著化合物濃度的增加，細(xì)胞抑制率逐漸增加，成活率逐漸下降，呈劑量依賴效應(yīng)，IC50值均在μmol/L水平，隨著細(xì)胞系抑制作用的不同，IC50也呈現(xiàn)一定的差異，其中對(duì)Hela和HCT116的抑制效果最明顯，IC50值相當(dāng)，分別為8.68、9.65 μmol/L，后續(xù)的抗腫瘤實(shí)驗(yàn)選取Hela細(xì)胞系進(jìn)行。見(jiàn)表1。

表1 ZY0625對(duì)不同腫瘤細(xì)胞系的MTT實(shí)驗(yàn)

注：IC50：半抑制濃度

2.3 ZY0625對(duì)體外表達(dá)的Pin1活性的抑制

活性測(cè)定選取的底物是suc-ala-glu-pro-phe-pNA（pNA為對(duì)硝基苯胺），它以80%～95% trans-和5%～20% cis-構(gòu)象復(fù)合物形式存在，已知的內(nèi)肽酶如chymotrypsin-糜蛋白酶僅識(shí)別含脯氨酸的反式構(gòu)象底物，并從C-末端把4-NA殘基切割下來(lái)，使溶液呈現(xiàn)淡黃色并引起390 nm的吸收，而順式構(gòu)象的底物cis-suc-AEPF-pNA將會(huì)被體外重組蛋白Pin1轉(zhuǎn)化成trans-suc-AEPF-pNA，進(jìn)一步被糜蛋白酶切割，使390 nm的吸收值進(jìn)一步增加。在抑制劑存在的情況下，Pin1蛋白的活性被抑制，轉(zhuǎn)化效率降低，引起390 nm吸光值降低。苯并呋喃類衍生物ZY0625在μmol/L水平抑制Pin1蛋白的活性，IC50值為6.06 μmol/L。

2.4 ZY0625可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡

Annexin V/FITC雙染法結(jié)果顯示，苯并呋喃類衍生物ZY0625能促進(jìn)HCT116細(xì)胞的凋亡。7.71 μmol/L（培養(yǎng)基稀釋）的ZY0625作用12 h，早期凋亡細(xì)胞的比例占到了43.82%，作用24 h早期凋亡細(xì)胞的數(shù)量占到了68.12%，顯示出促凋亡作用；而隨著作用劑量的增大，早期凋亡的比例明顯增長(zhǎng)，最高濃度12.85 μmol/L（培養(yǎng)基稀釋）作用下早期凋亡細(xì)胞的數(shù)量占到了總細(xì)胞數(shù)的94.32%，絕大部分細(xì)胞發(fā)生了早期凋亡，而不加藥的對(duì)照組90%以上為活細(xì)胞，見(jiàn)圖2、表2。以上結(jié)果提示，ZY0625可促進(jìn)Hela細(xì)胞凋亡。其中ZY0625采用培養(yǎng)基稀釋。

2.5 ZY0625對(duì)細(xì)胞正常形態(tài)的影響

顯微鏡下觀察，不加藥的對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)（圖3，100×），大小均勻，胞體圓整，胞質(zhì)透亮，形態(tài)規(guī)則，輪廓清晰。6.43 μmol/L（培養(yǎng)基稀釋）的苯并呋喃類衍生物ZY0625處理后大部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化（圖3），呈圓形皺縮，單個(gè)散在細(xì)胞間距明顯變大，胞體縮小，并從培養(yǎng)皿壁上脫落，細(xì)胞間連接消失，數(shù)量較對(duì)照組細(xì)胞數(shù)明顯減少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ZY0625可使人宮頸癌Hela細(xì)胞形態(tài)發(fā)生不同程度的改變，降低細(xì)胞密度，引起癌細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死，證實(shí)ZY0625對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。

圖3 ZY0625對(duì)Hela細(xì)胞形態(tài)的影響（100×）

2.6 ZY0625可使細(xì)胞周期阻滯

FACS顯示，在同一作用時(shí)間點(diǎn)，與不加藥的空白對(duì)照組比較，隨著苯并呋喃類衍生物ZY0625濃度增加，Hela細(xì)胞在G0/G1期細(xì)胞比例增加；同一作用濃度，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Hela細(xì)胞周期也變現(xiàn)出相似的阻滯，即G0/G1期細(xì)胞比例增加。以上結(jié)果提示， ZY0625可使Hela細(xì)胞發(fā)生周期阻滯，阻礙細(xì)胞有絲分裂期，從而抑制細(xì)胞增殖。見(jiàn)圖4、表3。其中ZY0625采用培養(yǎng)基稀釋。

2.7 ZY0625降低周期蛋白D1蛋白表達(dá)量結(jié)果

從Western Blotting的結(jié)果可以看到，與不加藥的空白對(duì)照組比較，苯并呋喃類衍生物ZY0625作用下Cyclin D1的表達(dá)量下降，且呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性，即同一濃度隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)Cyclin D1的表達(dá)量逐漸減少，同一作用時(shí)間隨著作用濃度的增大，Cyclin D1的表達(dá)量也隨著降低（圖5)。其中ZY0625采用培養(yǎng)基稀釋。

2.8 ZY062與Pin1表達(dá)量的關(guān)系

苯并呋喃類衍生物ZY0625作用前后Pin1蛋白的表達(dá)量基本無(wú)差異（圖6)。其中ZY0625采用培養(yǎng)基稀釋。

3 討論

基于Pin1對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)控以及和腫瘤發(fā)生的密切關(guān)聯(lián)，Pin1已成為引人關(guān)注的靶點(diǎn)。通過(guò)反義核酸的策略或者表達(dá)顯性失活的Pin1來(lái)降低其活性能造成腫瘤細(xì)胞增殖的抑制并能逆轉(zhuǎn)Ras-或Neu-誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化[7]。同樣地，Pin1抑制劑也能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，成為抗腫瘤藥研發(fā)的一個(gè)熱點(diǎn)[8-9]。目前，Pin1抑制劑包括多肽類[9-11]、通過(guò)篩選天然產(chǎn)物庫(kù)得到的有機(jī)小分子化合物（如Juglone）和設(shè)計(jì)合成的分子[12-13]。

本研究室致力于利用定靶的酵母模型進(jìn)行抗腫瘤藥物的篩選。在真核生物中，多肽脯氨?；?lè)串悩?gòu)酶是高度保守的，人Pin1與酵母中的同系物Essp1有45%的相同性，并能在功能上取代Essp1p[14]。因此，利用功能缺陷的溫度敏感型Essp1酵母突變株和野生型酵母菌株進(jìn)行Pin1抑制劑初篩，在溫敏突變株和野生型菌株上具有不同MIC的陽(yáng)性化合物有可能也是人Pin1的抑制劑。對(duì)初篩得到的候選化合物需進(jìn)一步在分子和細(xì)胞水平驗(yàn)證活性。本研究通過(guò)溫度敏感型突變株L94P和野生型菌株303-1a對(duì)本室的化合物庫(kù)的篩選，得到了一個(gè)在2個(gè)菌株上具有不同MIC值的候選化合物ZY0625，在體外表達(dá)的Pin1測(cè)活系統(tǒng)上檢測(cè)了此化合物的活性，驗(yàn)證了其具有抑制Pin1催化順?lè)串悩?gòu)反應(yīng)的能力，IC50值為6.06 μmol/L。除此之外，ZY0625還能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，在受檢的幾種細(xì)胞系中對(duì)人宮頸癌細(xì)胞Hela的抑制作用尤為明顯。在細(xì)胞增殖周期中，Cyclin D1是G~S期時(shí)相轉(zhuǎn)變調(diào)控點(diǎn)（R point）重要調(diào)控因子，對(duì)決定細(xì)胞進(jìn)入S期起調(diào)控作用[15-16]。Pin1可直接或間接與CyclinD1相互作用而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[17-18]。另?yè)?jù)報(bào)道，Pin1功能阻抑還可激發(fā)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序[19]。接下來(lái)本研究利用流式細(xì)胞儀和Western blotting分別檢測(cè)了ZY0625對(duì)Hela細(xì)胞周期和凋亡以及對(duì)Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)ZY0625能導(dǎo)致Hela的G1期阻滯并伴隨CyclinD1的蛋白表達(dá)量下降，此外，ZY0625還能誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡。這一系列的結(jié)果證實(shí)ZY0625能通過(guò)抑制Pin1的活性發(fā)揮抗腫瘤作用。在庫(kù)中檢索此化合物的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)為苯并呋喃衍生物，以往的研究多關(guān)注于此類化合物的抗骨質(zhì)疏松作用[20]，本研究首次揭示了Pin1為苯并呋喃衍生物抗腫瘤作用的靶點(diǎn)之一，為今后其綜合利用提供了理論依據(jù)。

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（收稿日期：2014-03-13本文編輯：衛(wèi)軻）

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（收稿日期：2014-03-13本文編輯：衛(wèi)軻）

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[17]秦文華，付春景.小鼠cyclin A2正義和反義真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2012，50（31）：1-3，7.

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[20]劉宗英.抗流感病毒藥物及抗骨質(zhì)疏松藥物的合成與篩選研究[D].北京：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，2006.

（收稿日期：2014-03-13本文編輯：衛(wèi)軻）