殷玉生，張 帆，安榆林

(1.江陰出入境檢驗檢疫局，江蘇 江陰 214431； 2.江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇 南京 210009)

基于線粒體COI基因鑒定大小蠹屬昆蟲

殷玉生1，張 帆1，安榆林2

(1.江陰出入境檢驗檢疫局，江蘇 江陰 214431； 2.江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇 南京 210009)

以口岸經(jīng)常截獲的紅脂大小蠹、黃杉大小蠹、山松大小蠹、間大小蠹、紅翅大小蠹和落葉松大小蠹等6種大小蠹屬昆蟲為樣本，根據(jù)其昆蟲檢索表制作了近緣關(guān)系樹；利用分子手段對其線粒體COI基因進行擴增，分析同源序列的多樣性、遺傳距離和系統(tǒng)進化關(guān)系，并將近緣關(guān)系樹和分子進化樹進行比較，研究利用分子手段對大小蠹屬昆蟲進行快速鑒定的可行性和準確性。結(jié)果表明：同種的大小蠹堿基差異較小，而不同種間的堿基差異較大，能明顯區(qū)分出不同種；大小蠹屬的遺傳距離和鄰接法系統(tǒng)進化樹也證實，分子鑒定結(jié)果和檢索表分類的結(jié)果一致?？衫梅肿予b定的方法對不同種的大小蠹屬昆蟲進行快速準確的鑒定。

大小蠹屬；形態(tài)學(xué)；COI基因；分子鑒定

大小蠹屬(Dendrotonus)隸屬于鞘翅目(Coleptera)小蠹科(Scolytidae)海小蠹亞科(Hylestininae)根小蠹族(Hylurgini)，是重要的林木害蟲，主要危害松屬、云杉屬、黃杉屬和落葉松屬等，該屬(非中國種)被列入我國進境植物檢疫性有害生物名錄。大小蠹屬在全世界共記錄19種，中、北美洲分布17種，歐洲和亞洲共2種，我國本土大小蠹僅有華山松大小蠹(Dendroctonusarmandi)和云杉大小蠹(D.micans)。大小蠹屬害蟲在大爆發(fā)時，寄主選擇專一性變?nèi)酰梢晕：λ械尼樔~樹種。例如1955—1984年間加拿大不列顛哥倫比亞省的云杉受到了紅翅大小蠹(D.rufipennis)的攻擊，造成了1400萬m3的云杉受損；落葉松大小蠹(D.simple)曾經(jīng)在美國造成了落葉松林超過10%的樹木死亡[1]。

北美是我國進口圓木的主要來源地之一，材種均為針葉樹，都是該屬的寄主，而我國緯度和氣候條件均與北美相似，利于大小蠹屬的定殖，因此一旦有大小蠹進入我國，極有可能擴散為害。最典型的例子即為紅脂大小蠹(D.valens)，該蟲于20世紀80年代傳入我國，1999年在山西爆發(fā)成災(zāi)，造成數(shù)萬公頃的油松死亡[2]。目前該蟲已擴散到河南、河北、陜西、甘肅5省，對我國生態(tài)系統(tǒng)安全構(gòu)成嚴重威脅[3]。鄧皓中[4]通過計算大小蠹屬昆蟲重要潛在外來入侵種的危險性綜合評估風(fēng)險值來評判大小蠹昆蟲的風(fēng)險等級，結(jié)果顯示山松大小蠹、南松大小蠹(D.frontalis)、紅翅大小蠹、西松大小蠹(D.brevicomis)、黃杉大小蠹和落葉松大小蠹為高度危險級，云杉大小蠹和紅脂大小蠹為中度危險級。

近年來，我國口岸頻繁截獲大小蠹屬昆蟲，對大小蠹屬昆蟲進行準確、快速的鑒定可以有效阻止其入侵，目前主要依據(jù)其形態(tài)學(xué)特征列出的昆蟲分類檢索表(identification key)對大小蠹屬進行分類鑒定。分類檢索表是鑒定昆蟲種類的工具，它廣泛應(yīng)用于各分類階元的鑒定。檢索表的編制是用對比分析和歸納的方法，從不同階元(目、科、屬或種)的特征中選出比較重要、突出、明顯而穩(wěn)定的特征，根據(jù)它們之間的相互絕對性狀，作成簡短的條文，按一定的格式排列而成。能夠反映一定的生物進化關(guān)系，是昆蟲分類工作重要的基礎(chǔ)。

但在檢疫過程中，由于大小蠹屬常以幼蟲等非成蟲蟲態(tài)出現(xiàn)，現(xiàn)有的鑒定方法和口岸快速鑒定技術(shù)尚不完善等原因，有1/3截獲的害蟲未能鑒定到種[4]，這對于我國的有害生物檢驗檢疫工作造成不利影響。因此，需要探索新的鑒定技術(shù)彌補現(xiàn)有鑒定手段的不足。線粒體細胞色素C氧化酶亞基I(mtDNA COI)基因結(jié)構(gòu)相對保守，而種間變異較大，利用COI基因進行近緣種間的鑒定和系統(tǒng)進化研究已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。如Stauffer等[5]使用COI基因序列，鑒定了歐洲的7種齒小蠹，常虹等[6]應(yīng)用基于COI基因片段的DNA條形碼成功進行了齒小蠹屬昆蟲的分類鑒定。

大小蠹屬作為重要的檢疫性有害生物，對其進行快速鑒定具有重要意義。殷玉生等[7]測定了紅脂大小蠹等5種大小蠹的COI基因片段，發(fā)現(xiàn)利用COI可以較好地反應(yīng)大小蠹樣本的來源地。本文收集了6種口岸經(jīng)常截獲的大小蠹樣本，并將這6種常見大小蠹屬昆蟲根據(jù)其昆蟲檢索表制作了近緣關(guān)系樹；利用分子手段對其線粒體COI基因進行擴增，分析了同源序列的多樣性、遺傳距離和系統(tǒng)進化關(guān)系，并將近緣關(guān)系樹和分子進化樹進行比較，研究利用分子手段對大小蠹屬昆蟲進行快速鑒定的可行性和準確性。

1 材料與方法

1.1 試驗樣本

供試樣本為來自世界各地的6種大小蠹，每種選取3個重復(fù)，具體情況見表1。

1.2 試驗過程

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定分析 根據(jù)大小蠹屬昆蟲檢索表[8]，利用Edraw mind map簡化繪制了形態(tài)學(xué)上的大小蠹屬種間關(guān)系樹。

1.2.2 分子方法鑒定

1)DNA提取。將供試樣本使用磁珠法[9]提取DNA，設(shè)計特異性引物進行PCR擴增。

2)PCR擴增。反應(yīng)體系：DNA模板1 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1) 2.0 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)2.0 μL，上下游引物(10 mmol·μL-1)各1 μL，ExTaqDNA聚合酶(250 U) 0.3 μL，加水補足25 μL。

表1 供試大小蠹信息

引物：上游：5’-TCGCATATTATTAGGCAAGAAAGAG-3’； 下游：5’-AGAAATGTTGTGGGAAGAAAG-3’。

反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性45 s，47 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

序列分析：取擴增成功的PCR產(chǎn)物50 μL，直接送金斯瑞生物科技有限公司進行測序，以PCR引物為測序引物進行雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

利用Edraw mind map繪制大小蠹屬種間關(guān)系樹。所得大小蠹COI序列用分子遺傳進化分析軟件MEGA 3.0[10]進行比對，并計算遺傳距離，用其中的鄰近距離法構(gòu)建基于COI序列的大小蠹屬昆蟲個體的NJ系統(tǒng)進化樹，以Kimura 2-paramete為模型，系統(tǒng)樹分支的置信度采用自展法重復(fù)檢測1000次。

圖1 大小蠹屬形態(tài)特征的種間關(guān)系

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定分析

根據(jù)大小蠹屬昆蟲檢索表[8]，選取紅脂大小蠹、紅翅大小蠹、黃杉大小蠹、山松大小蠹、落葉松大小蠹和間大小蠹6種大小蠹，將這6種大小蠹按照形態(tài)特征[6]做出近緣關(guān)系圖(圖1)。從圖1可以看出依形態(tài)特征分類，這6種大小蠹主要分為2大支系：紅脂大小蠹單獨成為一支系，其它大小蠹為第2支系。在第2支系中，落葉松大小蠹和黃杉大小蠹關(guān)系較近，組合在一起，它們又與紅翅大小蠹的關(guān)系相對密切；而山松大小蠹和間大小蠹的親緣關(guān)系較近，組合在一起。

2.2 序列比對分析

利用特異引物對大小蠹屬6個種(紅脂大小蠹、紅翅大小蠹、山松大小蠹、黃衫大小蠹、落葉松大小蠹和間大小蠹)共18個樣本的mtDNA COI基因進行PCR擴增，對測序后的目的條帶進行拼接裁剪后，片段大約為530 bp(圖2)。

將克隆到的COI基因到NCBI網(wǎng)站上進行BLAST搜索，結(jié)果證實克隆得到的18條COI基因均屬于大小蠹屬COI基因序列，且同源性為99%，說明克隆的序列準確可靠。

對6種大小蠹COI序列比對發(fā)現(xiàn)，所有變異均為堿基置換，未發(fā)現(xiàn)堿基的缺失和插入；其中變異位點為147個，保守位點383個。該段序列A、T、G、C含量分別為20.53%、38.41%、15.96%、15.10%；A+T含量較高，為68.94%，明顯高于G+C含量，表現(xiàn)出A+T的偏好性，符合昆蟲線粒體基因堿基組成的基本特征。同種大小蠹堿基差異較小而不同種間的堿基差異較大。結(jié)果顯示不同種大小蠹的COI序列有各自明顯的特征序列，能夠清晰地區(qū)分出大小蠹的不同種。

2.3 遺傳距離分析

計算所測試樣本的種內(nèi)和種間遺傳距離(表2)，發(fā)現(xiàn)種內(nèi)平均遺傳距離在0～0.039之間，種間平均遺傳距離在0.084～0.181之間。其中，黃杉大小蠹、落葉松大小蠹和間大小蠹的3個樣本的種內(nèi)遺傳距離為0，表明所有的3個樣本在所測COI部分基因序列中沒有發(fā)生任何變異；紅翅大小蠹種內(nèi)的遺傳距離最大，達0.039，表明所選取的紅翅大小蠹樣本在COI部分基因序列上存在較大的變異。

形態(tài)學(xué)鑒定表明，黃杉大小蠹與落葉松大小蠹的形態(tài)特征較為接近，對這2種大小蠹COI基因部分序列進行距離分析發(fā)現(xiàn)，這2種大小蠹之間的遺傳距離最小，為0.084。試驗樣本中山松大小蠹與間大小蠹間的遺傳距離為0.102，對比形態(tài)學(xué)鑒定近緣關(guān)系圖發(fā)現(xiàn)，這2種大小蠹的形態(tài)特征也較為接近。

2.4 系統(tǒng)進化樹分析

基于6種大小蠹共18個樣本的COI基因構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹(圖3)顯示，落葉松大小蠹與黃杉大小蠹聚在一起，說明它們之間的親緣關(guān)系最近，它們又與紅翅大小蠹的親緣關(guān)系較為接近，這與形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果一致。間大小蠹和山松大小蠹的親緣關(guān)系最近，與紅脂大小蠹較遠，與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。由圖3可以看出，同一種大小蠹聚在同一小支；近緣種聚在一起，如黃杉大小蠹和落葉松大小蠹，說明利用COI基因可以區(qū)分不同種的大小蠹。

圖2 6種大小蠹的COI部分基因序列比對結(jié)果

紅脂大小蠹山松大小蠹黃杉大小蠹紅翅大小蠹間大小蠹落葉松大小蠹紅脂大小蠹0.027山松大小蠹0.1610.003黃杉大小蠹0.1520.1230紅翅大小蠹0.1810.1650.1570.039間大小蠹0.1680.1020.1120.1750落葉松大小蠹0.1580.1050.0840.1490.1400

以Xylothrips flavipes的COI基因序列為外群；分支置信度為1000次重復(fù)得到的自展值。 圖3 鄰接法構(gòu)建的6種大小蠹的系統(tǒng)進化樹

3 結(jié)論與討論

隨著生物科學(xué)的發(fā)展，分子技術(shù)在昆蟲鑒定上的應(yīng)用越來越廣泛，早在1998年，安榆林等[11]就應(yīng)用RAPD技術(shù)分析松墨天牛(Monochamusalternatus)、云杉大墨天牛(M.urussovi)和云杉小墨天牛(M.sutor)的DNA多態(tài)性，證實該技術(shù)可以有效鑒定天牛幼蟲。也有研究表明：利用mtDNA Cytb基因?qū)麑嵪墝俚拈傩嵪?Bactroceradorsalis)、瓜實蠅(B.cucurbitae)、南瓜實蠅(B.tau)、番石榴實蠅(B.correcta)、具條實蠅(B.scutellata)、黑漆實蠅(B.scutellaris)共6種實蠅進行分析，對6種實蠅共72個個體的mtDNA Cytb基因進行擴增測序，得到38種單倍型，發(fā)現(xiàn)了116個變異位點中的30個較為穩(wěn)定，結(jié)果表明mtDNA Cytb基因可以作為這6種實蠅種類鑒別的分子標記[12]。

據(jù)報道，近年來我國口岸所截獲的大小蠹屬以黃杉大小蠹、紅翅大小蠹和山松大小蠹居多，這3種大小蠹被定為高度危險級[4]?？诎稒z疫作為防治大小蠹害蟲傳入我國的重要防線有著不可替代的作用，因此我國的學(xué)者和檢疫工作者對大小蠹屬的鑒定也越來越重視。目前對大小蠹屬成蟲的形態(tài)學(xué)鑒定基本成熟，鑒定特征日趨完善，但在檢疫工作中，截獲標本的很大部分為早期形態(tài)(卵、幼蟲和蛹)的昆蟲或肢體殘缺的蟲體，這些蟲態(tài)的鑒定特征較為接近，難以單純的根據(jù)形態(tài)學(xué)特征對不同種類的大小蠹昆蟲進行鑒定。近年來分子標記技術(shù)越來越多的用于昆蟲種類鑒定，如邱寶利等[13]成功的利用分子標記技術(shù)對煙粉虱寄生蜂-蚜小蜂進行分類鑒定。岳巧云等[14]利用COI基因?qū)γ紫?Sitophilusoryzae)、玉米象(Sitophiluszeamais)等昆蟲的幼蟲進行種類鑒定，結(jié)果表明DNA條形碼技術(shù)能準確進行昆蟲幼蟲種類的鑒定。

本研究選取紅脂大小蠹、紅翅大小蠹、中歐山松大小蠹、黃杉大小蠹、間大小蠹和落葉松大小蠹共6種大小蠹，對其線粒體COI基因進行測序，并計算供試樣本的種內(nèi)和種間遺傳距離，研究發(fā)現(xiàn)，種內(nèi)平均遺傳距離為0.012，黃杉大小蠹與落葉松大小蠹的種間遺傳距離最小，為0.084；山松大小蠹與間大小蠹間的遺傳距離為0.102，COI基因鑒定結(jié)果均符合形態(tài)特征的鑒定結(jié)果，說明利用COI的該片段可以很好的區(qū)分大小蠹屬的不同種類。同時，基于Kimura 2-parameter模型構(gòu)建了6種大小蠹屬的NJ系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示，同一物種可以聚為同一小支；近緣種聚集在一起，進化樹結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，能夠滿足大小蠹屬不同種類的鑒定需要。研究結(jié)果表明，將形態(tài)特征和分子生物學(xué)手段結(jié)合起來，能夠有效提高大小蠹昆蟲鑒定的準確率和速度，對口岸工作人員在工作中快速檢疫大小蠹屬昆蟲有著積極作用。

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Identification ofDendrotonusInsects Based on the Mitochondrial COI Gene

YIN Yu-sheng1，ZHANG Fan1，AN Yu-lin2

(1.JiangyinEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau，Jiangyin214431，Jiangsu，China；2.JiangsuEntry-exitInspectionandQuarantineBureauNanjing210009,Jiangsu,China)

TakingDendrotonusvalens，D.pseudotsug，D.ponderosae，D.adjunctus，D.rufipennisandD.simplex6Dendrotonusspecies often intercepted in ports as the smaples，this paper constructed a Close Sib Relationship Tree；it used molecule measures to amplify mitochondrial COI genes，it analysed the relationships among same source sequence diversity，heredity distance and system evolution，and Close Sib Relationship Tree and Molecule Evolution Tree were compared，and it researched the feasibility and accuracy ofDendrotonusinsects rapid identification with the molecular techniques.The results showed that the homogeneousDendrotonusbases had the small difference and different kinds of it had the larger difference，the different species could be clearly distinguished；theDendrotonusgenetic distance and Neighbour-Joining System Evolution Tree also confirmed that the molecular identification results and the retrieval table classification results were the same.The molecular identification methods were used to do the fast accurate identification for different kinds ofDendrotonusinsects.

Dendrotonus；morphology；COI gene；molecular identification

10.13428/j.cnki.fjlk.2014.01.014

2013-06-17；

2013-07-26

科技部質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(201110038)；江蘇出入境檢驗檢疫局基金課題(2008KJ37)

殷玉生(1971—)，男，安徽樅陽人，江陰出入境檢驗檢疫局農(nóng)藝師，碩士，從事植物檢疫工作。E-mail：yinys@jsciq.gov.cn。

S786.38

A

1002-7351(2014)01-0063-05