曹 玲 劉莉莉 王連芝 付 蕾

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040

中藥指紋圖譜是指中藥材、提取物或中藥制劑等經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標(biāo)示該中藥材、提取物或中藥制劑特性的共有峰的圖譜。從1984年香港中文大學(xué)中藥研究中心提出了開展中藥成分 “指紋”鑒定工作的設(shè)想以來，我國(guó)就開始了指紋圖譜的研究[1]。國(guó)家藥品監(jiān)督管理局于2000年頒布了《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）》[2]，要求中規(guī)定，為確保中藥注射劑質(zhì)量穩(wěn)定、可控，中藥注射劑在固定了中藥材品種、產(chǎn)地和采收期的前提下，需要制訂中藥材、有效部位或中間體、注射劑的指紋圖譜。特別是在《中國(guó)藥典》（2010年）中，建立了能反映中藥整體特性的色譜指紋圖譜方法（如滿山紅油、薄荷素油、積雪草總苷、莪術(shù)油、丹參酮提取物、丹參總酚酸提取物、三七總皂苷和三七三醇皂苷等藥材及其提取物）。指紋圖譜技術(shù)在我國(guó)中藥質(zhì)控方面得到了迅速發(fā)展。

2000年羅國(guó)安等[3]提出了多維指紋圖譜的概念。多維指紋圖譜，即采用多種分析儀器聯(lián)用的模式來建立指紋圖譜（如 HPLC-DAD-MS、HPLC-MS-MS、GC-MS、CE-MS[4]）。多維指紋圖譜的優(yōu)點(diǎn)是在色譜分離的同時(shí)還能進(jìn)行光譜的在線檢測(cè)，從而產(chǎn)生的數(shù)據(jù)既包括色譜的化學(xué)信息又包括光譜的信息。因此，這一方法特別適合中藥及其制劑這一復(fù)雜體系的測(cè)定。

建立多維指紋圖譜的組合方式主要包括：不同柱子的串并聯(lián)、不同檢測(cè)器的串并聯(lián)、不同色譜方法的組合及不同儀器間的組合。建立多維指紋圖譜的一些常見聯(lián)用技術(shù)主要有高效液相色譜-光電二極管陣列檢測(cè)器（HPLC-DAD）、高效液相色譜-光電二極管陣列檢測(cè)器-質(zhì)譜（HPLCDAD-MS）、高效液相色譜-光電二極管陣列檢測(cè)器-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（HPLC-DAD-ELSD）、高效液相色譜-光電二極管陣列檢測(cè)器-核磁（HPLC-DAD-NMR）、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜（CE-MS）、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）等。

1 HPLC-DAD

高效液相色譜儀的DAD檢測(cè)到的圖譜是三維譜圖，用DAD建立指紋圖譜，得到的圖譜就是最簡(jiǎn)單的多維指紋圖譜。DAD的光柵在流通池后，用陣列二極管同時(shí)測(cè)定各個(gè)波長(zhǎng)的光強(qiáng)度，因此在每一個(gè)色譜時(shí)間點(diǎn)上都可以同時(shí)得到紫外光譜圖，而且得到的光譜圖會(huì)隨著色譜保留時(shí)間方向上的化學(xué)成分和濃度的不同而發(fā)生變化。測(cè)得的數(shù)據(jù)中既包含色譜信息也包含光譜信息。色譜的保留時(shí)間結(jié)合光譜信息可以用來進(jìn)行定性鑒定，而色譜的峰高與峰面積等可以用來進(jìn)行定量檢測(cè)[5]。

謝顯珍等[6]利用HPLC-DAD建立了黃芪藥材中黃酮類化合物的色譜指紋圖譜。在利用聯(lián)用色譜提供的色譜以及光譜信息的基礎(chǔ)上，利用一些化學(xué)計(jì)量學(xué)方法獲取了主要黃酮類物質(zhì)的光譜圖，將這些光譜圖與標(biāo)準(zhǔn)圖譜相對(duì)照，以定性指紋圖譜中主要的黃酮類組分，進(jìn)而表征和建立了不同產(chǎn)地黃芪藥材中黃酮類化合物特征色譜指紋圖譜。此外，胡建蘭等[7]利用HPLC-DAD建立了涼膈散湯劑的指紋圖譜，建立了該方湯劑整體特征的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。侯志飛等[8]利用HPLC-DAD建立了梔子及其炮制品指紋圖譜，應(yīng)用在線紫外光譜對(duì)指紋峰進(jìn)行了定性歸屬研究。胡虒堯等[9]建立了當(dāng)歸芍藥散的HPLC-DAD指紋圖譜，根據(jù)HPLC圖中各峰的保留時(shí)間和DAD檢測(cè)的紫外光譜圖的進(jìn)行比對(duì)，認(rèn)定了峰的來源，對(duì)方中部分特征峰進(jìn)行了歸屬。袁曉等[10]建立了茜草HPLC-DAD指紋圖譜，提供了茜草藥材的質(zhì)量控制方法。

2 HPLC-DAD-MS

質(zhì)譜檢測(cè)器（MSD）在選擇性、通用性、靈敏度和化合物的分子量及結(jié)構(gòu)信息的提供等方面均有較突出的優(yōu)點(diǎn)。HPLC-DAD-MS聯(lián)用技術(shù)實(shí)現(xiàn)了在分離成分時(shí)，能夠在線提供各指標(biāo)性成分或活性成分化學(xué)結(jié)構(gòu)信息，能夠提供深層次分析信息的工具，而且檢測(cè)的高靈敏度可以解決一些藥材近緣品種指紋圖譜中雖然有指紋特征，但信號(hào)微弱，又有必要辨認(rèn)組分的分析[11]。

早在2001年，戴德舜等[12]及曹進(jìn)等[13]就利用HPLCDVD-MS-MS技術(shù)對(duì)桂枝湯A部分雙向調(diào)節(jié)樣品及單向升溫樣品進(jìn)行指紋圖譜的確定。該實(shí)驗(yàn)分析了MS總離子流圖及高效液相譜圖主峰對(duì)應(yīng)的可能分子量，根據(jù)藥典和桂枝湯中五種單味藥有效成分的相關(guān)資料，推測(cè)出了桂枝湯A部分雙向調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)可能對(duì)應(yīng)單味藥的物質(zhì)來源。并且利用LC-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)桂枝湯A部分以及組成桂枝湯五味單味藥A部分進(jìn)行多維全息化學(xué)特征譜的指認(rèn)。通過Mass的質(zhì)荷比（M/Z）值及HPLC色譜峰的保留時(shí)間相互對(duì)照，將桂枝湯A部分中主要成分進(jìn)行歸屬，為進(jìn)一步研究藥效作用的走向提供了有效途徑。聶晶等[14]采用HPLC-UVD對(duì)生血寧片的指紋圖譜進(jìn)行了研究，并利用UPLC/DAD/Q-TOF-MS技術(shù)對(duì)其中主要色譜峰進(jìn)行了歸屬，為更好地控制生血寧片質(zhì)量提供可靠依據(jù)。

3 HPLC-DAD-ELSD

蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）的工作原理是，色譜柱流出物經(jīng)過蒸發(fā)器將流動(dòng)相蒸發(fā)，待測(cè)成分變成微粒氣霧流，一定強(qiáng)度的光照射此微粒，測(cè)定其散射光，散射光的強(qiáng)度取決于測(cè)定的微粒的大小和多少，而與其結(jié)構(gòu)關(guān)系不大。因此，對(duì)于沒有紫外吸收的皂苷類等化合物來說，用ELSD特別適合。DAD可檢測(cè)出有共軛體系的化合物的特征吸收，ELSD可檢測(cè)皂苷類化合物等紫外吸收不明顯的化合物的吸收信息。應(yīng)用二極管陣列檢測(cè)-蒸發(fā)光散射檢測(cè)聯(lián)用測(cè)定中藥材及其制劑可有效的互補(bǔ)。

閆艷等[15]建立了酸棗仁藥材HPLC-DAD-ELSD指紋圖譜?，F(xiàn)代藥理研究表明，酸棗仁中鎮(zhèn)靜催眠的主要有效成分是皂苷類和黃酮類。皂苷類成分大多沒有明顯的紫外吸收，用紫外檢測(cè)器測(cè)定效果不好，基線漂移嚴(yán)重，相應(yīng)值低。應(yīng)用ELSD測(cè)定皂苷類成分效果好，基線穩(wěn)定，有很好的響應(yīng)值。因此，采用HPLC-DAD-ELSD法既能測(cè)定酸棗仁藥材中的黃酮類成分，又能測(cè)定皂苷類成分，一次進(jìn)樣可同時(shí)測(cè)得兩類成分的指紋圖譜，從而使得對(duì)酸棗仁的質(zhì)量評(píng)價(jià)更加全面。此外，蘇碧茹等[16]采用HPLC-DAD-ELSD串聯(lián)技術(shù)建立了黃芪藥材的HPLC-DAD-ELSD色譜指紋圖譜，為黃芪藥材的全面質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。石媛慧等[17]采用DAD串聯(lián)ELSD建立不同品種石斛的HPLCDAD-ELSD指紋圖譜，可直接反映石斛品種與化學(xué)成分變化的關(guān)系。

4 HPLC-DAD-NMR

核磁共振波譜法（NMR）是將自旋核放入磁場(chǎng)，用適宜頻率電磁波照射它們，其吸收能量，發(fā)生原子核能級(jí)躍遷，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生核磁共振信號(hào)，從而得到核磁共振譜。核磁共振譜能夠提供的參數(shù)主要有化學(xué)位移、質(zhì)子的裂分峰數(shù)、偶合常數(shù)及各組峰的積分高度等。而這些參數(shù)與有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)有著非常密切的關(guān)系。故此，核磁共振譜是鑒定有機(jī)化合物、金屬有機(jī)化合物及生物分子結(jié)構(gòu)和構(gòu)象等的重要工具之一。NMR作為一種波譜型指紋圖譜與HPLC這一色譜型指紋圖譜相結(jié)合，在中藥材及中藥復(fù)方這一復(fù)雜體系中將所有成分的信息盡可能多的表現(xiàn)出來，具全面性和整體性的優(yōu)勢(shì)。

林云良等[18]建立了金銀花的HPLC-DAD-NMR指紋圖譜。采用高效液相色譜法及核磁共振的方法，對(duì)山東產(chǎn)金銀花的乙醇提取物中的活性成分進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，建立了其指紋圖譜。此兩種方法聯(lián)用作為檢測(cè)手段能夠很好地表征中藥材及其制劑的內(nèi)在化學(xué)成分特征及其相對(duì)之間含量差異。

5 CE-MS

毛細(xì)管電泳法（CE）是指帶電質(zhì)點(diǎn)（膠粒或離子）在電解質(zhì)溶液中在電場(chǎng)的作用下，向荷電相反電極遷移的現(xiàn)象稱為電泳。因?yàn)閹щ娰|(zhì)點(diǎn)的電荷數(shù)量、電荷符號(hào)和質(zhì)點(diǎn)大小的差別，遷移速度有所不同，從而分離。電泳若是在毛細(xì)管中進(jìn)行的則為毛細(xì)管電泳法。毛細(xì)管電泳法不僅能分離分析有機(jī)化合物，無機(jī)陰、陽(yáng)離子，手性分子，中性分子和大分子，而且具有柱效高、樣品用量少、分析速度快、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)。CE指紋圖譜具有很好的專屬性，當(dāng)與高靈敏度的質(zhì)譜檢測(cè)器聯(lián)用時(shí)，能夠得到較低的檢測(cè)限。此外，質(zhì)譜還可以提供分子量用于定性，多級(jí)質(zhì)譜還可以提供結(jié)構(gòu)的碎片信息，而用于結(jié)構(gòu)鑒定。因此，毛細(xì)管電泳質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)用于中藥的研究，應(yīng)用前景比較廣闊。孫毓慶等[19]系統(tǒng)總結(jié)了毛細(xì)管電泳指紋圖譜以及毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在中藥質(zhì)量控制中的作用。

6 GC-MS

氣相色譜法（GC）是以氣體為流動(dòng)相的色譜分離技術(shù)。在中藥質(zhì)量現(xiàn)代化的研究過程中，氣相色譜法有較為重要的地位。對(duì)于含有揮發(fā)性成分、主要成分為脂肪酸類的中藥材及揮發(fā)油等成分的質(zhì)量控制有著不可替代的作用和比較理想的分離效果。氣相色譜法和質(zhì)譜聯(lián)用具有比較好的定性功能，使中藥材及其制劑指紋圖譜的研究更加系統(tǒng)和完整，并且為解決中藥研究中缺乏標(biāo)準(zhǔn)品提供了可行之路。

華永麗等[20]建立了當(dāng)歸及其炮制品揮發(fā)油的GC-MS化學(xué)指紋圖譜。以當(dāng)歸及其不同炮制品為樣品，以氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)為分析方法，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)分析手段，建立了從化學(xué)指紋圖譜中發(fā)現(xiàn)不同炮制品潛在標(biāo)志物的方法。耿放等[21]建立了桂枝茯苓丸脂溶性成分GC-MS指紋圖譜，從整體定性方面評(píng)價(jià)桂枝茯苓丸的質(zhì)量?jī)?yōu)劣。潘瑞景等[22]對(duì)不同產(chǎn)地半枝蓮藥材及其混淆品的GC-MS指紋圖譜進(jìn)行研究，證明了九個(gè)不同產(chǎn)地半枝蓮具有統(tǒng)一性，與混淆品之間具有明顯的差異。

7 不同儀器的組合

用不同儀器建立指紋圖譜，這些儀器在技術(shù)上及在原理上能夠優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，能夠合理交叉地整合定性信息，為綜合鑒定中藥質(zhì)量的全貌奠定基礎(chǔ)，這為尋找中藥大復(fù)方體系的標(biāo)準(zhǔn)制劑提供一種探索模式，且具有現(xiàn)實(shí)性、有效性、可靠性和可操作性。

孫國(guó)祥等[23-24]建立了防風(fēng)通圣丸及柏子養(yǎng)心丸的高效液相色譜指紋圖譜、紫外光譜指紋圖譜、紅外光譜指紋圖譜及熱值譜，形成多元多維方法交叉評(píng)價(jià)防風(fēng)通圣丸質(zhì)量的方法。用190～400 nm的紫外區(qū)間紫外光譜指紋圖譜表達(dá)π→π*，n→π* 和 n→σ* 的化學(xué)組分，用 4000～400 cm-1紅外光譜指紋圖譜表達(dá)單鍵、雙鍵及三鍵等的振動(dòng)（或轉(zhuǎn)動(dòng)）對(duì)中紅外線的吸收，這些均以光譜點(diǎn)為評(píng)價(jià)單元。用燃燒焓衡量中藥的有機(jī)物達(dá)到高價(jià)氧化態(tài)的熱釋放度，以此來揭示有機(jī)組分的總量。故以此四種多元多維指紋圖譜的交叉整合能夠監(jiān)測(cè)中藥各類化學(xué)成分分布的情況，為中藥的質(zhì)量控制提供了一種簡(jiǎn)單探索性的方法。此外，陳新新等[25]建立了六味地黃丸（濃縮丸）的五波長(zhǎng)高效液相色譜指紋圖譜、紫外指紋圖譜和導(dǎo)數(shù)指紋圖譜，為其藥效物質(zhì)均一性的評(píng)價(jià)提供了一種有效的方法。孫國(guó)祥等[26]建立了維C銀翹片紫外指紋圖譜、紅外指紋圖譜及測(cè)定燃燒熱，利用兩種光譜指紋圖譜實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥全化學(xué)成分的（雙鍵、三鍵和飽和鍵）全面監(jiān)測(cè)。

總之，中藥及其制劑化學(xué)成分非常復(fù)雜，用單一指紋圖譜不能兼顧所有化學(xué)成分。多維指紋圖譜實(shí)現(xiàn)了分析方法多元化和檢測(cè)方式的多維化，能夠獲得中藥的立體空間指紋圖譜。多維指紋圖譜實(shí)現(xiàn)了分析方法多元化和檢測(cè)方式的多維化，從而能夠獲得中藥的立體空間指紋圖譜。由于多元多維指紋圖譜技術(shù)從多元的分析方法和多維的檢測(cè)方式來獲得中藥化學(xué)組分的全信息而形成立體多息譜，因此，只有對(duì)其進(jìn)行合理的整合和有效的數(shù)據(jù)挖掘才能夠從多側(cè)面、整體方位詳細(xì)描述及準(zhǔn)確表征中藥中全部組分的含量分布狀況[23]。故此，多維指紋圖譜目前面臨的難題是如何快速找到適合的評(píng)價(jià)分析方法，從而建立科學(xué)的評(píng)價(jià)體系，能夠解釋和評(píng)價(jià)中藥中包含的藥效成分信息，能夠把數(shù)據(jù)的應(yīng)用從低層次的簡(jiǎn)單查詢，提升到在數(shù)據(jù)中挖掘知識(shí)，獲取數(shù)據(jù)背后潛在的、有用的信息，以此來描述中藥多維指紋圖譜的整體特征，對(duì)于現(xiàn)階段而言，亟需解決的問題是將各種聯(lián)用方式、各種儀器得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行合理的整合，從而達(dá)到全面控制中藥及其制劑的質(zhì)量。希望能夠建立切實(shí)有效的中藥指紋圖譜，為中藥質(zhì)量控制服務(wù)，使對(duì)中藥及其制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)更加全面準(zhǔn)確。多維指紋圖譜的出現(xiàn)即是為了更加全面地反映中藥各類成分的全貌，因此，中藥指紋圖譜的發(fā)展必將是多儀器、多測(cè)定方式的聯(lián)用的多維指紋圖譜。

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