邵巧燕， 戴錦泉， 吳 斌， 施曉容， 陳林鶯， 陳余朋

熱性驚厥(febrile seizures，F(xiàn)S)是一種嬰幼兒最常見的驚厥性疾病，多發(fā)生在6個月～5歲。FS發(fā)病機(jī)制尚不確定，目前認(rèn)為是遺傳、環(huán)境等多種因素相互作用的結(jié)果。研究報道，長時間反復(fù)發(fā)作的FS可導(dǎo)致幼鼠發(fā)育過程中腦損傷[1]，表現(xiàn)為幼鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡增多、記憶力下降甚至顳葉癲癇的發(fā)生[2-3]。因此，F(xiàn)S腦損傷機(jī)制探討及預(yù)防治療是小兒神經(jīng)學(xué)科的重點(diǎn)研究內(nèi)容之一?？鼓憠A能藥物長托寧(鹽酸戊乙奎醚注射液)是一種新型的抗膽堿藥物。有研究表明：予腹腔內(nèi)注射中等劑量的長托寧能緩解缺氧缺血再灌注后海馬區(qū)域神經(jīng)元損傷，起著腦神經(jīng)元保護(hù)作用[4]。本研究將低劑量海人藻酸(kainic acid，KA)與脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)腹腔內(nèi)注射建造幼鼠FS模型，探討長托寧干預(yù)對FS所致海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動物與分組 清潔級14日齡SD幼鼠3窩共54只，雌雄各半，體質(zhì)量40～50 g[福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK(閩)2004-0002]。幼鼠出生14 d內(nèi)母乳喂養(yǎng)，母鼠同籠，保持良好生活環(huán)境衛(wèi)生，每日更換食物、飲水。出生后第14 d隨機(jī)分為鹽水對照組、FS模型組、長托寧干預(yù)組(n=18)；建模后12 h、24 h及48 h各組分別處死幼鼠6只。

1.2試劑 LPS(批號：2010AB4CA24, 美國Sigma公司)；KA(批號：2010ACD268, 美國Sigma公司)；長托寧(批號：H20020606，成都力斯特制藥股份有限公司);原位凋亡細(xì)胞試劑盒(美國Roche公司)。

1.3方法

1.3.1模型建立及干預(yù) FS對照組及長托寧干預(yù)組幼鼠測定基礎(chǔ)體溫之后，予腹腔注射LPS (200 μg/kg)，肛溫儀測量肛溫，1次/10 min；2 h后肛溫上升至38.5～40 ℃時，注射KA(1.75 mg/kg)于腹腔，鹽水對照組給予等量生理鹽水腹腔內(nèi)注射[5-6]。長托寧干預(yù)組均在開始造模同時腹腔內(nèi)注射長托寧(0.45 mg/kg)[4]，鹽水對照組、FS模型組在相應(yīng)時間腹腔內(nèi)注射等量體積生理鹽水。觀察記錄各組幼鼠FS發(fā)作時的潛伏期、肛溫、持續(xù)時間和級別。操作時間在1 d內(nèi)完成。實驗所在環(huán)境安靜，保持濕度45%～70%，溫度26～30 ℃。

1.3.2驚厥臨床觀察

1.3.2.1驚厥潛伏期及持續(xù)時間觀察 驚厥潛伏期是指大鼠腹腔注射LPS后至發(fā)生驚厥之間的時間，以min為記錄單位；驚厥持續(xù)時間是指大鼠由剛開始發(fā)生驚厥至驚厥停止之間的時間，以min為記錄單位。

1.3.2.2驚厥程度分級 應(yīng)用盲法觀察與記錄評分[6-7]。記錄幼鼠驚厥潛伏期、體溫、持續(xù)時間及級別(評分)：0級：無驚厥 (0分)；1級：面部抽動，凝視、咀嚼(1分)；2級：點(diǎn)頭、濕狗性抖動或搔抓(2分)；3級：前肢陣攣或抽搐(3分)；4級：伴有后肢站立性全身強(qiáng)直發(fā)作(4分)；5級：伴站立后并摔倒的全身強(qiáng)直-陣攣樣發(fā)作(5分)。出現(xiàn)3級以上發(fā)作提示造模成功。

1.3.3標(biāo)本采集 應(yīng)用乙醚麻醉幼鼠，通過左心室-主動脈插管，肝素鈉生理鹽水沖管后，再予多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(PBS 0.1 mmol/L)灌注，斷頭后迅速剝離海馬，放置于40 g/L多聚甲醛中，4 ℃固定24 h，經(jīng)脫水、石蠟包埋后，再應(yīng)用振蕩切片機(jī)從視交叉處始行冠狀連續(xù)切片，片厚大約5 μm[6]。

1.4海馬組織病理學(xué)檢查 幼鼠海馬神經(jīng)組織應(yīng)用10 %多聚甲醛固定，予石蠟包埋，只取冠狀切面，H-E染色，應(yīng)用雙盲法于顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)改變[6]。

1.5TUNEL法檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡 按照檢測凋亡細(xì)胞試劑盒說明書標(biāo)記凋亡細(xì)胞[6]，過程包括：常規(guī)切片脫蠟脫水；于蛋白酶K(20 μg/mL溶在Tris/HCl中，pH 7.4～8.0)室溫孵育15min；于50 μL TUNEL反應(yīng)混合溶液濕盒內(nèi)37 ℃孵育60 min；于50 μL轉(zhuǎn)化劑-POD濕盒中37 ℃孵育30 min；最后于50～100 μL二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物溶液室溫孵育10 min。顯微鏡下進(jìn)行分析，細(xì)胞核中見棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。每組分別選3張切片，每張切片各選陽性細(xì)胞最為集中的5個高倍視野(×400)，計算每個高倍視野陽性細(xì)胞，并取平均值。

2 結(jié) 果

2.1LPS聯(lián)合KA誘導(dǎo)幼鼠驚厥模型 3組幼鼠在開始藥物注射初1 h內(nèi)肛溫?zé)o明顯改變，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.61，P>0.05)；2 h后FS模型組及長托寧干預(yù)組幼鼠肛溫明顯升高，4 h達(dá)高峰[(39.82±0.23)℃]，3組之間比較差別具有統(tǒng)計學(xué)意義[F(2 h)=36.41，P<0.01；F(3 h)=276.56，P<0.01；F(4 h)=103.67，P<0.01]。FS模型組、長托寧干預(yù)組驚厥時發(fā)作肛溫差別統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在誘導(dǎo)幼鼠FS發(fā)作過程中，F(xiàn)S模型組在注射KA后15～30 min均出現(xiàn)點(diǎn)頭、流涎、肢體抖動等動作，后較快出現(xiàn)前肢陣攣，進(jìn)一步發(fā)展為全身強(qiáng)直陣攣或摔倒，驚厥呈反復(fù)發(fā)作，驚厥發(fā)生率為100%，多在Ⅳ～Ⅴ級；鹽水對照組均無驚厥發(fā)作。

2.2長托寧干預(yù)對幼鼠驚厥發(fā)作影響 FS模型組、長托寧干預(yù)組幼鼠驚厥潛伏時間相近。與FS模型組比較，長托寧干預(yù)組幼鼠驚厥發(fā)作程度減輕，級別多在Ⅲ～Ⅳ級，出現(xiàn)嚴(yán)重驚厥(Ⅳ～Ⅴ級)發(fā)生率為55.6%(10/18)，F(xiàn)S模型組幼鼠出現(xiàn)嚴(yán)重驚厥發(fā)生率為77.8 %(14/18)；2組幼鼠驚厥潛伏時間分別為(55.41± 9.93)min和(55.20±11.23)min，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.062,P>0.05)； 2組驚厥平均持續(xù)時間分別為(27.74±10.92)min和(23.74±8.60) min，長托寧干預(yù)組可減少驚厥持續(xù)時間(t=3.4，P<0.05)；2組驚厥平均級別分別為(3.80±0.98)min和(3.18±0.91)min，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.05，P<0.05)，長托寧可減輕驚厥發(fā)作程度(表1)。

表1 各組幼鼠驚厥狀況比較

2.3海馬神經(jīng)元病理學(xué)檢查 鹽水對照組海馬神經(jīng)元細(xì)胞層次排列齊、染色均勻，胞核居中圓而大，異染色質(zhì)少，顏色淡藍(lán)，胞質(zhì)多見突起；FS模型組幼鼠海馬CA1區(qū)切片上多見神經(jīng)元變性，表現(xiàn)主要為細(xì)胞核染色質(zhì)粗大，細(xì)胞核大小不一，細(xì)胞排列紊亂，部分細(xì)胞見空泡變。長托寧干預(yù)組也出現(xiàn)神經(jīng)元變性，但程度較輕，總體排列尚整齊，形態(tài)接近正常(圖1)。

2.4CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡細(xì)胞數(shù)檢測 造模后鹽水對照組海馬CAl區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)檢測數(shù)較少，與長托寧干預(yù)組比較，F(xiàn)S模型組海馬CA1區(qū)可見較多TUNEL細(xì)胞(圖2)。在不同時間點(diǎn)(12 h、24 h及48 h)分別將3組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行比較，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義[F(12 h)=100.18，P<0.05]，[F(24 h)=99.88，P<0.05]，[F(48 h)=79.20，P<0.05](表2)。

FS：熱性驚厥. A：鹽水對照組細(xì)胞排列規(guī)則，神經(jīng)元輪廓清晰，胞核大而圓；B：FS模型組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞可見細(xì)胞形態(tài)不一，空泡細(xì)胞多，排列無序；C：長托寧干預(yù)組可見少許神經(jīng)元變性，細(xì)胞排列尚規(guī)則.

A：鹽水對照組海馬神經(jīng)CA1區(qū)見少許TUNEL陽性細(xì)胞；B：FS模型組海馬神經(jīng)CA1區(qū)見較多TUNEL陽性細(xì)胞；C：長托寧干預(yù)組海馬神經(jīng)CA1區(qū)見少量TUNEL細(xì)胞.

表2 各組幼鼠海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)比較

3 討 論

FS是比較常見的兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，發(fā)病率高?，F(xiàn)已證實：長時間FS可導(dǎo)致發(fā)育中腦損害，尤其是在嬰兒可引起神經(jīng)傳導(dǎo)通路改變，并增加顳葉癲癇的易感性[8-10]。因此，建立合理的FS腦損傷模型，探討針對FS腦損傷的保護(hù)措施十分必要。文獻(xiàn)表明，長托寧能夠減少缺血再灌注腦損傷作用[11]。本試驗研究長托寧對FS幼鼠的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的影響，從而進(jìn)一步了解和明確長托寧對FS所致腦損傷的保護(hù)作用。

研究表明，出生后14 d幼鼠的腦發(fā)育程度與1歲兒童相當(dāng)，28～30 d幼鼠的腦發(fā)育程度與2歲兒童相當(dāng)[12]，故選用14日幼鼠建立模型最為恰當(dāng)。采用LPS聯(lián)合低劑量KA腹腔內(nèi)注射誘導(dǎo)建立幼鼠FS模型，這是最接近人類FS發(fā)作機(jī)制的動物模型，也是最常用、最有效的FS模型[6]。FS模型組與長托寧干預(yù)組均出現(xiàn)幼鼠體溫上升及驚厥樣發(fā)作表現(xiàn)，驚厥成功率100%，提示造模成功。同時還發(fā)現(xiàn)，LPS聯(lián)合KA誘導(dǎo)FS模型組幼鼠海馬CA1區(qū)凋亡陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多[13],提示FS可導(dǎo)致一定程度的腦損傷。因此，針對FS腦損傷保護(hù)方面的研究是十分必要的。

長托寧作為一種新型選擇性抗膽堿藥物，臨床已應(yīng)用多年，主要是用于麻醉前給藥及有機(jī)磷中毒治療。近年來，人們關(guān)注到長托寧不但有中樞及周圍抗膽堿作用，還有改善微循環(huán)、抗氧化應(yīng)激、減少炎癥因子釋放及減輕細(xì)胞凋亡的作用。研究表明，長托寧可通過抑制細(xì)胞外信號相關(guān)激酶(ERK1/2)及P38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)的活化，可減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，緩解膿毒性急性肺損傷、減輕幼鼠單腎動脈缺血再灌注的腎功能[14-15]。由于長托寧較好的血腦屏障通透性，其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷也有類似抗炎療效。文獻(xiàn)報道，采用四動脈結(jié)扎法致大鼠全腦缺血再灌注，長托寧治療可減少谷氨酸釋放和谷氨酸受體表達(dá)，減輕大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元缺血再灌注損傷[16]。Huang報道長托寧可阻斷NF-κB從細(xì)胞漿遷移至細(xì)胞核和P38絲裂原活化蛋白激酶的磷酸化，從而減輕由LPS誘導(dǎo)的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞炎癥[16]。以上研究表明，長托寧可能通過抑制細(xì)胞外信號相關(guān)激酶(ERK1/2)及p38MAPK的活化，減少氧化應(yīng)激反應(yīng)對缺血缺氧再灌注腦損傷或LPS誘導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥有保護(hù)作用。

FS誘發(fā)多次驚厥發(fā)生時，大腦處于缺氧及相對缺血狀態(tài)，對缺氧缺血敏感的海馬CA1區(qū)域表現(xiàn)更為明顯，神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生ATP不足，不足以維持細(xì)胞內(nèi)外離子平衡，尤其是ATP依賴性鈣離子通道外流受限，細(xì)胞內(nèi)鈣超載，由此激發(fā)各種興奮性氨基酸及自由基大量釋放，最終導(dǎo)致海馬神經(jīng)元損傷。

本研究采用LPS和KA誘導(dǎo)幼鼠FS發(fā)作。LPS是內(nèi)毒素的主要成分，極微量內(nèi)毒素就會引起體溫上升。KA是興奮性氨基酸L-谷氨酸的一種類似物，其與谷氨酸受體結(jié)合后，可引起神經(jīng)元去級化從而誘發(fā)驚厥發(fā)作。建模同時長托寧干預(yù)組幼鼠加入長托寧進(jìn)行干預(yù)處理。研究結(jié)果表明：與FS模型組比較，長托寧干預(yù)組幼鼠驚厥程度較輕、驚厥發(fā)作時間較短；H-E染色觀察，長托寧干預(yù)組幼鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞變性程度較模型組減輕；TUNEL法檢測幼鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡細(xì)胞數(shù)量較FS模型組明顯減少。結(jié)果提示，長托寧干預(yù)能夠在一定程度上減輕FS對幼鼠海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元損傷，與Shang等研究相符[16]，推測長托寧可能是通過減輕海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡而起到其腦保護(hù)作用。

長托寧是一種能通過血腦屏障的高選擇性新型抗膽堿類藥，對FS所致腦損傷有一定保護(hù)作用,其機(jī)制尚不十分清楚,結(jié)合文獻(xiàn)報道，筆者認(rèn)為其機(jī)制可能如下:(1)阻斷LPS引起的細(xì)胞內(nèi)激活, 抑制NF-ΚB和p38MAPK活化,阻斷細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)失控性釋放；(2)清除自由基、穩(wěn)定細(xì)胞膜等作用。因此，長托寧可能是一種新型FS腦保護(hù)的藥物，值得進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] Mortazavi F, Ericson M, Story D,etal. Spatial learning deficits and emotional impairments in pentylenetetrazol-kindled rats[J].Epilepsy&Behavior,2005,7(4):629-638.

[2] Chang Y C, Huang C C, Huang S C,etal. Long-term effects of febrile seizures[J].ChangGungMedicalJournal, 2008,31(2):125-134.

[3] Céline Dub, Richichi C, Bender R A.etal. Temporal lobe epilepsy after experimental prolonged febrile seizures: prospective analysis[J].Brain,2006,129(4):911-922.

[4] Cao H J,Sun Y J,Zhang T Z,etal. Penehyclidine hydrochloride attenuates the cerebral injury in a rat model of cardiopulmonary bypass[J].CanJPhysiolPharmacol,2013,91(7):521-527.

[5] Heida J G,Teskey G C,Pittman,etal. Febrile convulsions induced by combination of lipopoly-sacch aride and low-dose kainic acid enhance seizure susceptibility, not epilepto-genesis, in rats[J].Epilepsia, 2005,46(12):1898-1905.

[6] 施曉容,邵巧燕,劉俊紅,等.脂多糖聯(lián)合低劑量海人藻酸誘導(dǎo)建立幼鼠FS腦損傷模型[J]. 實用兒科臨床雜志,2012,27(18):1432-1435.

[7] Jiang W,Duong T M,DeLanerolle N C,etal. Neuropathology of Hyperthermic seizures in the rat[J].Epilepsia,1999,40(1):5-19.

[8] 常杏芝,秦 炯,吳希如.幼年幼鼠反復(fù)FS腦損傷的研究[J].中國當(dāng)代兒科雜志,2002,4(6):439-442.

[9] Reid A Y,Pittman Q J,Teskey G C,etal. A prolonged experimental febrile seizure results in motor map reorganization in adulthood[J].NeurobiolDis,2012,45(2):692-700.

[10] Dub C M,Ravizza T,Hamamura M,etal. Epileptogenesis provoked by Prolo-nged experimental febrile seizures: Mechanisms and biomarkers[J].Neurosci,2010,30(22):7484-7494.

[11] Wang Y,Ma T,Li M,etal. Regulated hypoxia/reperfusion-dependent modulation of ERK1/2, cPLA2, and Bcl-2/Bax: a potential mechanism of neuroprotective effect of penehyclidine hydrochloride[J].InenationalJNeuroscience,2011,121(8):442-449.

[12] 施曉容,邵巧燕,劉俊紅,等. 脂多糖聯(lián)合海人藻酸誘導(dǎo)的FS導(dǎo)致幼鼠海馬神經(jīng)元凋亡[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2012,46(2):104-107.

[13] Zhan J,Liu Y,Zhang Z,etal. Effect of penehyclidine hydrochloride on expressions of MAPK in mice with CLP-induced acute lung injury[J].MolBiolRep,2011,38(3):1909-1914.

[14] Wang Y P,Li G,Ma L L,etal. Penehyclidine hydrochloride ameliorates renal ischemia-reperfusion injury in rats[J].JSurgRes,2014,186(1):390-397.

[15] Shang Y,Gu P F,Shang Y,etal.Penehyclidine hydrochloride inhibits glutamate release and related research in global brain ischemia/reperfusion rats[J].ZhongguoYingYongShengLiXueZaZhi,2011, 27(3):353-356.

[16] Huang C,He J,Chen Y,etal. Penehyclidine hydrochloride inhibits the LPS-induced inflammatory response in microglia[J].JSurgRes,2014,188(1):260-267.