陳 凌， 吳 贇， 汪義永， 魏 斌

近年來多項研究表明，感染因素在動脈粥樣硬化及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[1-2]。牙周炎是發(fā)生在牙齒周圍組織的感染性疾病，是多種全身性疾病如冠心病、糖尿病、低體質(zhì)量早產(chǎn)兒等的危險因素[3]。福賽坦氏菌(Tannerellaforsythensis，Tf)與牙周炎發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。研究顯示，Tf既可定植于牙周炎病變部位，也可在牙周健康部位檢出，在牙周炎患者或牙周炎癥部位檢出率較高[4]。

本研究采用PCR擴增細菌DNA片段的方法檢測慢性牙周炎患者的齦下菌斑、動脈粥樣硬化斑塊中Tf，通過比對2個樣本中Tf的同源性，研究Tf和動脈粥樣硬化的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1對象 2010年11月-2011年12月，在住院患者中選擇伴有慢性牙周炎并且需要行動脈外科手術(shù)病例21例，其中男性13例，女性8例，年齡中位數(shù)74.5歲(62～93歲)；其中牙周病輕度3例，中度8例，重度10例。慢性牙周炎納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)成年人，男女不限，年齡不限；(2)有明顯的菌斑、牙石及局部刺激因素，且與牙周組織的炎癥和破壞程度比較一致；(3)病情進展緩慢，也可間有快速進展的活動期；(4)全身一般健康，也可有某些危險因素，如吸煙、精神壓力、骨質(zhì)疏松等；(5)已排除侵襲性牙周炎；(6)根據(jù)累及的牙位數(shù)，可進一步分為局限型(<30%位點)和廣泛型(>30%)；(7)根據(jù)牙周附著喪失(AL)的程度，可分為：輕度(AL 1～2 mm)、中度(AL 3～4 mm)和重度(AL≥5 mm)。排除標(biāo)準(zhǔn)：剔除患有其他全身系統(tǒng)性疾病、藥物過敏史、3月內(nèi)有抗生素、腎上腺皮質(zhì)激素、非甾體類抗炎藥、性激素及避孕藥等應(yīng)用史者，心梗發(fā)生以及牙周治療均須間隔6月以上。本研究通過福建醫(yī)科大學(xué)生物研究倫理審查委員會審查，所有研究對象均知情同意并簽字。

1.2方法

1.2.1主要試劑和設(shè)備 PCR反應(yīng)體系、細菌基因組DNA提取試劑盒、溶菌酶(北京天根生化科技有限公司)，基因組DNA純化試劑盒(Promega公司)，蛋白酶K(美國Sigma公司)，Tf國際參考標(biāo)準(zhǔn)菌株(四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生部重點實驗室提供)。Tf引物[5](上海生工生物工程有限公司合成)預(yù)期擴增片段長度為222 bp，退火57 ℃、30 s。ABI 9700 PCR擴增儀(美國ABI公司)，微量核酸-蛋白定量儀(德國Eppendorf公司)。

Tf引物：

上游：GTCGGACTAATACCTCATAAAACA

下游：TCGCCCATTGACCAATATT

1.2.2標(biāo)本的收集和處理 手術(shù)前一天所有患者進行全口天然牙的牙周袋探診深度(PD)、附著喪失(AL)、菌斑指數(shù)(PLI)、出血指數(shù)(SBI)、牙石指數(shù)(CI)檢查，由同一名醫(yī)生完成。齦下菌斑樣本的收集：選取患者口內(nèi)PD≥4 mm的4個不同位點的患牙，患牙牙周袋最深的部位作為采樣的位點，無菌齦上刮治器去除取樣牙的齦上菌斑，棉卷隔濕干燥，用另一無菌齦下刮治器刮取齦下菌斑，放入同一盛有生理鹽水的無菌Ep管中，-80 ℃保存。動脈粥樣硬化斑塊樣本的收集：由外科醫(yī)生在手術(shù)中收集，并立刻置于盛有生理鹽水的無菌Ep管中，-80 ℃保存。

1.2.3細菌DNA的提取 按細菌基因組DNA提取試劑盒說明操作提取標(biāo)準(zhǔn)菌株、齦下菌斑及動脈粥樣硬化斑塊標(biāo)本中的DNA序列。

1.2.4PCR反應(yīng)體系及條件 PCR反應(yīng)體系：DNA模板3 μL，2×Hot Start Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上游引物(25 μmol/L)0.3 μL，下游引物(25 μmol/L)0.3 μL，H2O 8.9 μL，總體積25 μL。PCR反應(yīng)條件參照文獻[5]。

1.2.5PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳、測序 取PCR擴增產(chǎn)物8 μL，2%瓊脂糖凝膠電泳，用紫外線檢測儀觀察擴增條帶，動脈粥樣硬化斑塊中檢測到的牙周致病菌送往英杰生命技術(shù)公司檢測。

2 結(jié) 果

2.1牙周臨床指標(biāo)檢測結(jié)果 PD(5.62±0.63)mm(3.84～6.47 mm)，AL(4.26±2.21)mm(1.46～6.72 mm)，SBI(2.84±0.67)(1.94～3.72)，PLI(2.24±0.37)(1.57～2.86)，CI(2.04±0.73)(1.25～2.83)。

2.2Tf的PCR擴增產(chǎn)物電泳Tf特異引物擴增后出現(xiàn)目的條帶，分子量大小與參考菌株基本相同，片段大小為200～300 bp，與預(yù)期的222 bp相符(圖1)。

1：Tf標(biāo)準(zhǔn)菌株；2：齦下菌斑Tf陽性樣本；3：動脈粥樣硬化斑塊Tf陽性樣本；4：Takara 100 bp DNA markers(dye plus)；5：空白對照組.

2.3Tf檢出率 21例中，動脈粥樣硬化斑塊中Tf陽性6例，檢出率29%；齦下菌斑中Tf陽性15例，檢出率71%；在同一患者齦下菌斑及動脈粥樣硬化斑塊中Tf檢測均陽性5例，檢出率24%。

2.4測序 將動脈粥樣硬化斑塊中檢測到的TfPCR產(chǎn)物測序，并將基因序列與GenBank中標(biāo)準(zhǔn)序列進行比對，表明是Tf(圖2，3)。

2.5同源性檢測 將同一患者2個樣本Tf均為陽性的的標(biāo)本PCR產(chǎn)物測序結(jié)果通過blast比對，發(fā)現(xiàn)其符合Genbank中的標(biāo)準(zhǔn)序列，這兩種不同來源的Tf間具有高度的同源性，基因序列相似度99%(圖4)。

圖2 動脈粥樣硬化斑塊中Tf PCR產(chǎn)物的部分基因測序結(jié)果

3 討 論

牙周炎癥感染的情況下，牙周支持組織受到不同程度的破壞，牙周袋內(nèi)的上皮組織可產(chǎn)生潰瘍，使牙周袋內(nèi)的病原菌可能進入血液，導(dǎo)致短暫、低水平的菌血癥發(fā)生。Tf與牙周炎發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，重度牙周病患者的齦下菌斑中經(jīng)?？蓹z出Tf。Tf為革蘭陰性厭氧菌，其細胞壁中的脂多糖可引發(fā)宿主免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)白細胞介素-1、6、8及腫瘤壞死因子-α等多種細胞因子產(chǎn)生，誘導(dǎo)細胞凋亡[6]。研究發(fā)現(xiàn)，牙周炎患者檢出Tf比率為56.5%，與牙周健康人群對比顯著增高；并且牙周破壞程度加劇，牙周袋內(nèi)檢測出Tf的比率也升高[7]。

圖3 動脈粥樣硬化斑塊中檢測到的Tf PCR測序結(jié)果與GenBank參考序列比對

圖4 齦下菌斑及動脈粥樣硬化斑塊中Tf 同源性比對

在病損的血管和動脈粥樣硬化斑塊里均檢測出口腔細菌感染物是支持慢性口腔感染與動脈粥樣硬化相關(guān)聯(lián)的有力證明。Chiu等收集了進行冠狀動脈搭橋手術(shù)的患者，發(fā)現(xiàn)術(shù)中取得的粥樣硬化斑塊中存在2種牙周來源的致病菌(牙齦卟啉單胞菌和血鏈球菌)[8]。Jain等發(fā)現(xiàn)，發(fā)生牙周炎的兔動脈粥樣硬化模型與無牙周炎模型相比，有更多類脂沉積于動脈壁，且隨著牙周炎的加重類脂的沉積程度越嚴(yán)重[9]。Figuero等研究了70例外周動脈疾病或腹主動脈瘤患者，發(fā)現(xiàn)其血管及血液樣本中常見牙周致病菌(伴放線聚集桿菌、牙齦卟啉單胞菌、直腸彎曲菌、Tf)檢出率分別為7.1%和11.4%[10]。Mahendra等收集了51例接受冠狀動脈搭橋的慢性牙周炎患者的冠狀動脈粥樣硬化斑塊標(biāo)本，結(jié)果表明伴放線聚集桿菌、Tf、牙齦卟啉單胞菌、牙齦卟啉單胞菌黏附因子菌毛蛋白A基因、齒垢密螺旋體檢出率分別為0，31.4%，45.1%，39.2%和51%[11]。楊泓等檢測動脈粥樣硬化斑塊中的3種牙周致病菌，發(fā)現(xiàn)重度牙周炎組Tf檢出率(25%)比輕度牙周炎組(7.69%)明顯增高[12]。安娜等研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣斑塊樣本中可檢出3種可疑牙周致病菌，其中牙齦卟啉單胞菌陽性率為30%，Tf陽性率為10%[13]。由此可見，多數(shù)研究都從動脈粥樣硬化斑塊檢測出牙周致病菌，從而確定牙周感染與動脈粥樣硬化的相關(guān)性。但是要確定分別從動脈粥樣硬化斑塊與牙周組織來源的致病菌之間的相似度究竟如何，需要同時檢測同一患者動脈粥樣硬化斑塊及齦下菌斑同種牙周致病菌并進行分析，比對兩種來源致病菌的相關(guān)性，此類相關(guān)研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，Tf在動脈粥樣硬化斑塊、齦下菌斑中的檢出率為29%和71%，檢出Tf的DNA符合Genbank中的標(biāo)準(zhǔn)序列，在同一患者齦下菌斑及動脈粥樣硬化斑塊中檢出率為24%，且2種不同來源的Tf間具有高度的同源性，其基因序列相似度為99%。本課題組前期已經(jīng)在慢性牙周炎患者的動脈粥樣硬化斑塊中找到了2種牙周致病菌(伴放線聚集桿菌、牙齦卟啉單胞菌)DNA[14]，與前期研究相比，Tf無論是在檢出率還是核酸的相似程度方面都更高，因此推測牙周感染中存在的Tf可能對動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展起到更為重要的作用，但仍需要大樣本的研究證實。

本研究結(jié)果提醒臨床醫(yī)生應(yīng)重視牙周疾病與心血管病的關(guān)系，在進行牙周衛(wèi)生指導(dǎo)時，提醒患者積極去除牙周組織可能存在的危險因素，降低動脈粥樣硬化及其他血栓栓塞性疾病發(fā)生的危險。

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