王承勇， 林 海， 王 錦， 危紅英， 張德慶， 盧 萌， 陳偉輝

成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖、分化和生長受到多重調(diào)節(jié)作用機(jī)制的影響，除了受局部生長因子、細(xì)胞因子及細(xì)胞黏附分子的調(diào)節(jié)作用外，還受到自主神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)[1-4]。Bjurholm等研究表明，在骨組織中存在無髓交感神經(jīng)[5]。交感神經(jīng)對(duì)于骨組織改建和新骨形成中的作用越來越受到重視。較早的研究顯示，6-羥基多巴胺(6-HODA)等藥物可使沙鼠中耳泡中破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，表現(xiàn)為骨吸收作用，認(rèn)為交感神經(jīng)能通過調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞活性，促進(jìn)骨吸收[6]；但最近的研究則提出相反的觀點(diǎn)，Cherruau的研究從不同角度提出，交感神經(jīng)興奮可以促進(jìn)骨吸收，減少骨形成[7]。

交感神經(jīng)通過分泌神經(jīng)介質(zhì)，包括兒茶酚胺類的β受體激動(dòng)劑以及NPY等神經(jīng)肽類物質(zhì)，在骨改建和骨愈合中的作用是復(fù)雜和廣泛的，對(duì)于其作用機(jī)制還未完全明確。本實(shí)驗(yàn)在建立去交感神經(jīng)支配動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，通過建立拔牙窩骨缺損模型，探討去交感神經(jīng)支配對(duì)拔牙窩新骨形成和骨改建的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物及儀器 5周齡清潔級(jí)雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量250～300 g[上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK(滬)2003-0003]；多功能顯微鏡(AX84U-MCB，日本奧林巴斯株式會(huì)社)，切片機(jī)(2035，德國徠卡微系統(tǒng)有限公司)，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求自制手術(shù)器械若干。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 (1)失交感神經(jīng)支配模型：具體建模方法參見文獻(xiàn)[8]。50只SD大鼠按5個(gè)時(shí)間點(diǎn)(1，3，7，14，21 d)分為5組，每組10只，其中2只為預(yù)實(shí)驗(yàn)大鼠，未列入最后數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。每組大鼠5只左側(cè)為頸上神經(jīng)節(jié)切除術(shù)組(SCGx)，右側(cè)為假手術(shù)組(CG)；另5只左側(cè)為CG組，右側(cè)為SCGx組；SCGx組為實(shí)驗(yàn)組，CG組為對(duì)照組。(2)拔牙窩骨愈合模型：10%水合氯醛300～350 mg腹腔注射麻醉，仰臥位，翻開口腔暴露上頜第一磨牙，分離牙齦，小刮匙挺出上頜第一磨牙，建立拔牙窩骨愈合模型。(3)不同時(shí)間點(diǎn)處死大鼠并行多聚甲醛內(nèi)灌注，切取大鼠上頜骨部分，置入新鮮配制4%多聚甲醛，4 ℃低溫固定過夜。微波法上頜骨快速脫鈣，持續(xù)脫鈣直到大頭針可以無阻力穿透上頜骨。

1.3H-E染色檢測拔牙窩 常規(guī)H-E染色，顯微拍照(×100)。利用Image-Pro Plus6.0軟件對(duì)照片進(jìn)行分析。選取拔牙窩區(qū)域作為興趣區(qū)域(AOI)，分析拔牙窩內(nèi)組織情況。分為以下成分：血凝塊和血痂(blood clot and scab, BCAS)、未礦化組織(non-mineralized tissue, NMT)、編織骨(woven bone, WB)、板層骨(lamellar bone, LB)、新生骨組織(new bone, NB)、拔牙窩面積(T.Ar)、新骨面積(B.Ar)，單位均為像素(pixel)。骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)包括：

新骨面積：B.Ar(NB)=WB+LB，表示拔牙窩內(nèi)新形成骨組織總和

骨體積分?jǐn)?shù)：BV/TV=B.Ar/T.Ar×100%，表示既定拔牙窩內(nèi)新骨形成面積與拔牙窩面積之比

各組分分?jǐn)?shù)(以BCAS為例)：BCAS/T.Ar×100%，表示拔牙窩內(nèi)各組成成分與拔牙窩面積之比

2 結(jié) 果

2.1各組拔牙窩組織形態(tài)學(xué) (1)1 d可見拔牙窩表面大量血性滲出物覆蓋，伴壞死及細(xì)菌感染。拔牙窩內(nèi)血凝塊形成，少量炎癥細(xì)胞浸潤，拔牙窩骨壁周圍可見殘留牙周膜以及纖維素性滲出物。未見新生血管形成，篩狀板周圍少量多核破骨細(xì)胞形成，伴少量骨吸收陷窩。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)3 d可見拔牙窩近牙槽嵴部分有大量肉芽組織形成，血凝塊機(jī)化，毛細(xì)血管形成，拔牙窩中部及底部可見明顯纖維化過程，成纖維細(xì)胞生長活躍，血管數(shù)目較頂部肉芽組織少，拔牙窩底及部分樣本拔牙窩壁形成纖維性骨痂，少量編織骨形成，可見破骨細(xì)胞及骨吸收陷窩增多。對(duì)照組成骨細(xì)胞及編織骨少于實(shí)驗(yàn)組。(3)7 d可見拔牙窩纖維細(xì)胞生長活躍，血凝塊被完全機(jī)化，拔牙窩整體充滿大量成熟的纖維組織，毛細(xì)血管相對(duì)生長活躍，可見明顯編織骨的形成，局部可見骨化現(xiàn)象。側(cè)壁出現(xiàn)骨吸收陷窩，篩狀板因吸收表現(xiàn)為部分連續(xù)性中斷，對(duì)照組毛細(xì)血管相對(duì)較少。(4)14 d可見纖維性骨痂充填牙槽窩，纖維組織成熟，成骨活動(dòng)明顯。新骨形成部位周圍大量成骨細(xì)胞以及毛細(xì)血管分布，骨小梁結(jié)構(gòu)明顯，部分底部骨組織形成板層骨形態(tài)。對(duì)照組結(jié)構(gòu)松散，排列欠規(guī)則。(5)21 d可見骨小梁生長至牙槽嵴頂，骨組織趨于成熟，但骨小梁結(jié)構(gòu)較無序。骨小梁周圍骨髓組織形成，血管數(shù)量明顯減少。板層骨結(jié)構(gòu)對(duì)照組明顯少于實(shí)驗(yàn)組(圖1)。

A～E：實(shí)驗(yàn)組；a～e：對(duì)照組. A、a：1 d；B、b：3 d；C、c：7 d；D、d：14 d；E、e：21 d. ：血凝塊和血痂；：牙周膜；：骨髓；：纖維性骨痂；：編織骨；：板層骨；：炎癥細(xì)胞；：血管.

2.2各指標(biāo)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果

2.2.1BV/TV 在術(shù)后早期，實(shí)驗(yàn)組新骨形成均較對(duì)照組快，表現(xiàn)為新骨形成量上的差異，在達(dá)到3周之后，新骨形成在量的方面，二者之間的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示新骨形成已經(jīng)趨近于穩(wěn)定的狀態(tài)(圖2)。

2.2.2拔牙窩各組成成分 1 d時(shí)間點(diǎn)，拔牙窩內(nèi)由BCAS和NMT(主要是殘余牙周膜)兩部分組成，組成比例基本一致，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3 d時(shí)間點(diǎn)，隨著BCAS機(jī)化的進(jìn)程，NMT開始明顯增多，但BCAS以及NMT在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有少量新生的WB出現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組多于對(duì)照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。7 d時(shí)間點(diǎn)，NMT在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，反證包括編織骨和板層骨在內(nèi)的NB之間，實(shí)驗(yàn)組量大于對(duì)照組。在NB中，WB之間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而LB差別則有意義。14 d時(shí)間點(diǎn)，NB及LB的形成上實(shí)驗(yàn)組均多于對(duì)照組；21 d時(shí)間點(diǎn)，NB形成上實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是在NB中，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在WB、LB比例之間的差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

SCGx:頸上神經(jīng)節(jié)切除術(shù)組;CG:假手術(shù)組. n=8. 與CG組比較,☆：P<0.05.

3 討 論

骨組織的改建是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過程，骨和骨膜上分布著豐富的交感神經(jīng)，而交感神經(jīng)來源的信號(hào)對(duì)成骨細(xì)胞以及破骨細(xì)胞的生長與分化起著特殊的刺激作用。神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂往往可以直接影響骨形成與改建，表現(xiàn)為局部骨質(zhì)減少、病理性骨折、骨折愈合異常、拔牙后牙槽骨吸收和過量骨痂形成等[4,9-10]。

表1 各組拔牙窩構(gòu)成

在之前的研究中，Sherman等利用6-HODA在沙鼠上進(jìn)行試驗(yàn)表明，失交感神經(jīng)支配可以導(dǎo)致骨吸收明顯增加，新骨形成減弱[11]。另一項(xiàng)研究也表明，在失交感神經(jīng)支配的下頜骨骨膜上破骨細(xì)胞增加[6]。其觀點(diǎn)支持交感神經(jīng)的作用是促進(jìn)骨形成，降低骨吸收。

另一方面，Togari的研究指出，交感神經(jīng)末梢對(duì)骨組織中的成骨細(xì)胞以及破骨細(xì)胞均產(chǎn)生影響[12]；且近年來的研究指出，交感神經(jīng)活動(dòng)對(duì)骨形成與改建有抑制作用，其作用通過活化成骨細(xì)胞上的β-腎上腺素受體，減少骨基質(zhì)形成[13-15]，又通過活化成骨細(xì)胞β-腎上腺素受體，增加了RANKL的表達(dá)，后者可以增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性和促進(jìn)破骨細(xì)胞形成增強(qiáng)骨吸收作用。Okada等研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用心得安這類β-腎上腺素受體抑制劑可以抑制牙周炎大鼠骨吸收，減少牙槽嵴的骨喪失[16]。近年來的研究均表明交感神經(jīng)作用可以抑制骨形成。

在本實(shí)驗(yàn)中，各時(shí)間段拔牙窩骨形成與改建過程在大體標(biāo)本以及形態(tài)學(xué)表現(xiàn)上同Sato等的研究類似[17]，僅在同一時(shí)間點(diǎn)的表現(xiàn)上略有不同。在拔牙術(shù)后3，7，14 d時(shí)間點(diǎn)上，實(shí)驗(yàn)組的新骨形成相對(duì)于對(duì)照組差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即失交感神經(jīng)側(cè)牙槽窩新骨骨量大于交感神經(jīng)支配側(cè)骨量，失交感神經(jīng)支配對(duì)新骨形成起到促進(jìn)作用。術(shù)后21 d時(shí)間點(diǎn)，2組之間差別已無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，新骨形成趨于穩(wěn)定，這說明在抑制交感神經(jīng)之后，可以更快地達(dá)到骨形成與骨吸收的平衡點(diǎn)。Haug等的研究從另一方面提出交感神經(jīng)與感覺神經(jīng)在神經(jīng)生長上存在著相互競爭的作用，選擇性的切斷一種神經(jīng)支配會(huì)導(dǎo)致另一種神經(jīng)過度生長，繼而通過增強(qiáng)感覺神經(jīng)對(duì)骨形成的促進(jìn)作用從而促進(jìn)新骨形成[18]。

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)新生骨組織中不同的骨質(zhì)成分進(jìn)行單獨(dú)分析發(fā)現(xiàn)，在術(shù)后3～21 d的骨愈合早期，新生骨組織變化具有特別意義，不僅表現(xiàn)為新骨形成，并在此過程中伴隨著骨改建和骨成熟。拔牙術(shù)后3～14 d時(shí)間點(diǎn)上不僅表現(xiàn)為總新骨形成差異，而且在成熟的板層骨形成差別也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這個(gè)差異在21 d最為明顯(P<0.01)。這說明失交感神經(jīng)支配對(duì)于新骨形成不僅表現(xiàn)在促進(jìn)骨形成，同時(shí)也促進(jìn)了新骨組織的成熟，從而證實(shí)交感神經(jīng)不僅抑制骨形成，也抑制骨改建，延遲了骨成熟，對(duì)于拔牙窩的完全骨愈合起到抑制作用。

綜上所述，失交感神經(jīng)支配不僅僅對(duì)骨形成具有促進(jìn)作用，對(duì)骨改建和新骨成熟也具有顯著的意義。

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